趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東淄博255036

間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中長鏈非編碼RNA調(diào)控作用研究進(jìn)展

趙培慶 王連慶 李 濤

山東省淄博市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東淄博255036

間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新與定向分化的干細(xì)胞，在組織修復(fù)與細(xì)胞生長發(fā)育中起重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)育過程中，部分長鏈非編碼RNA表達(dá)上調(diào)與下調(diào)，表明它可能是間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育中的重要調(diào)控點(diǎn)，雖然目前該方面的功能性研究比較少，但其強(qiáng)大的研究潛力已經(jīng)體現(xiàn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；長鏈非編碼RNA

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新與定向分化能力的細(xì)胞，1966首次發(fā)現(xiàn)時(shí)被冠以“成纖維祖細(xì)胞”之名，目前已經(jīng)證實(shí)它可以分化成骨骼、軟骨組織、脂肪組織及肌肉等組織，并且在組織修復(fù)及細(xì)胞生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過分泌前列腺素E2（PGE2）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1RA）、白細(xì)胞介素-7（IL-7）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-11（IL-11）等細(xì)胞因子及生長因子來影響免疫微環(huán)境，對(duì)損傷的組織進(jìn)行修復(fù)［3］。不同于胚胎干細(xì)胞，MSCs屬于成體干細(xì)胞，因此不具有無限自我更新和永生化能力［4］?；谝陨侠碚摶A(chǔ)，因此其修復(fù)調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。

1 lncRNAs的概念及在干細(xì)胞發(fā)育分化中的作用

長鏈非編碼RNA（longnoncoding RNAs，lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄長度大于200 bp的非編碼RNA，有的甚至超過10 kb，可以形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，表明它們參與基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制可能更加復(fù)雜。根據(jù)它們?cè)诨蚪M中的位置可以分為lincRNA、天然反義鏈lncRNA和內(nèi)含子區(qū)lncRNA［5］。目前已經(jīng)證實(shí)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后修飾水平進(jìn)行調(diào)控，對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、腫瘤診斷及闡述其分子機(jī)制方面越來越受到人們的重視。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在干細(xì)胞多能性及分化等方面起關(guān)鍵調(diào)控作用，Guttman等［6］通過轉(zhuǎn)錄測(cè)繪技術(shù)與染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)共發(fā)現(xiàn)40條與多能干細(xì)胞功能相關(guān)的lncRNAs，其中有20余條與多能標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子（Nanog，oct4）基因表達(dá)相關(guān)，表明其在胚胎干細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)控作用。同時(shí)，Chakraborty等［7］也鑒定出3條與維持多能干細(xì)胞特性的lncRNAs（Panct1-3）。在心肌細(xì)胞發(fā)育分化過程中，Wamstad等［8］也發(fā)現(xiàn)一條在其發(fā)育中起重要表觀遺傳調(diào)控作用的lncRNA。以上研究結(jié)果顯示，lncRNAs在干細(xì)胞的生長發(fā)育及分化過程中起重要調(diào)控作用，研究其調(diào)控過程及發(fā)現(xiàn)新的長鏈非編碼RNA勢(shì)必為干細(xì)胞相關(guān)研究找到新的途徑和方法。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中可能的最新調(diào)控策略

MSCs作為骨髓成骨細(xì)胞前體的重要來源，其分化增殖的時(shí)空特異性受到嚴(yán)格的調(diào)控。一般情況下，骨髓MSCs受遺傳和表觀遺傳機(jī)制調(diào)控，但具體的分子機(jī)制有待闡明，MSCs向成骨細(xì)胞分化主要涉及以下幾種信號(hào)傳導(dǎo)通路：TGF6信號(hào)通路、MAPK通路、Runx/osteorix信號(hào)通路、Notch通路、Wnt通路等［9］。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，如miR-125、miR-141及-200、miR-23等microRNA可通過抑制通路中Runx2蛋白等關(guān)鍵分子的表達(dá)對(duì)MSCs向成骨分化起抑制作用［10-11］；相反，miR-2861、miR-148b等［12-13］可通過激活成骨通路中關(guān)鍵分子，對(duì)成骨作用起正向調(diào)控。這些MSCs成骨調(diào)控因子構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)其成骨過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。已有研究證實(shí)lncRNAs可作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與其他RNA轉(zhuǎn)錄本競(jìng)爭(zhēng)相同的microRNA，從而抑制microRNA對(duì)其靶基因的調(diào)控，但其在MSCs成骨作用中調(diào)控microRNA的具體機(jī)制目前還未見報(bào)道。Ye等［14］發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM6B通過消除H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾對(duì)MSCs成骨分化進(jìn)行調(diào)控，表明通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制，KDM4B和KDM6B可作為治療靶點(diǎn)來控制MSCs分化過程，可為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病治療找到新的線索。近期，研究發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)化生長因子β途徑抑制劑（smallmolecular SB431542）可快速誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生MSCs［15］，這一發(fā)現(xiàn)表明MSCs可通過大量生產(chǎn)應(yīng)用于臨床治療與修復(fù)，但其中的具體調(diào)控分子機(jī)制目前還不是十分明確。體內(nèi)炎癥微環(huán)境對(duì)MSCs的調(diào)節(jié)也非常重要，微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和炎癥因子可以活化MSCs，誘導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)功能。最近Dang等［16］學(xué)者發(fā)現(xiàn)炎癥因子誘導(dǎo)的自噬可以對(duì)MSCs免疫功能產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)使MSCs的臨床治療產(chǎn)生新的期望?？傊?，闡明MSCs的調(diào)控機(jī)制可對(duì)臨床治療及其成骨分化調(diào)控產(chǎn)生重大影響，lncRNAs作為近期發(fā)現(xiàn)的基因“富礦”，雖然在調(diào)控MSCs方面報(bào)道較少，但它應(yīng)該在其細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

3 lncRNAs對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控作用

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及，lncRNAs的重要功能逐漸受到重視，lncRNAs可通過影響基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)修飾、蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)等方式對(duì)生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。

在MSCs向軟骨分化過程中，Wang等［17］發(fā)現(xiàn)有3638個(gè)lncRNAs有較大程度的變化（2166個(gè)表達(dá)上調(diào)及1472個(gè)下調(diào)），作者選擇了兩個(gè)表達(dá)上調(diào)的lncRNA ZBED3-AS1和CTA-941F9.9進(jìn)一步分析驗(yàn)證，結(jié)果表明它們?cè)谡T導(dǎo)分化后的第28天仍然持續(xù)高表達(dá)，提示可能參與了MSCs向軟骨分化的全過程。羅嘉全等［18］利用生物分析軟件分析了在MSCs成骨過程中成骨基因Smurf1、MSX1、BMP1相關(guān)的lncRNAs，包括uc003ups、AK096529、AK024937、AKl29811和K056311等。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNAs在MSCs成骨分化后其表達(dá)均較分化前下調(diào)，其中3個(gè)lncRNAs（AK096529、uc003ups、AK056311）變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其可能的機(jī)制是通過正向調(diào)控Smurf1，促使Smurf1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減少Runx2的降解，最終促進(jìn)MSCs的成骨過程。左長清等［19］用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了116個(gè)在MSCs成骨過程中差異表達(dá)的lncRNAs，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)lncRNA AK089560的表達(dá)值在C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的第2，4，6天明顯下降，可能的機(jī)制是它參與維持MSCs處于未分化狀態(tài)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)［20］，116個(gè)表達(dá)變化的lncRNAs中59個(gè)表達(dá)上調(diào)，57個(gè)則是表達(dá)下調(diào)；其中60.3%是基因間結(jié)構(gòu)區(qū)域，另20.7%是位于編碼區(qū)域；且24個(gè)lncRNAs都能找到相應(yīng)的毗鄰編碼基因所匹配，提示它們可能是lncRNAs的調(diào)控目標(biāo)基因。例如EGFR是成骨促進(jìn)因子Runx2和Osterix的抑制物，小鼠lincRNA0231可通過調(diào)控表皮生長因子受體信號(hào)通路來負(fù)向影響成骨過程；lncRNA NR_027652則通過影響DLK1、lincRNA0243通過影響IL-5參與了MSCs的成骨過程。程晨等［21］發(fā)現(xiàn)在MSCs成骨過程中表達(dá)明顯下調(diào)的lncRNAs有24條，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其中AK035085可能通過對(duì)成骨過程中關(guān)鍵基因抑制來起作用。Wang等［22］同樣用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些在成骨分化過程中的重要lncRNAs，最終證實(shí)lncRNA H19和uc022axw.1的表達(dá)上調(diào)可能參與了MSCs成骨分化的過程。Zhu等［23］報(bào)道，lncRNA-ANCR可以維持成骨細(xì)胞的非分化狀態(tài)，其分子機(jī)制主要是通過與EZH2作用來抑制Runx2蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致成骨分化降低；相反，下調(diào)lncRNAANCR則可促進(jìn)成骨分化。

MSCs在不同的解剖區(qū)域有不同的生物學(xué)活性，Dong等［24］據(jù)此通過芯片分析了骨髓中MSCs和牙周韌帶干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）中的lncRNAs表達(dá)差異情況，發(fā)現(xiàn)了457個(gè)表達(dá)上調(diào)及513個(gè)表達(dá)下調(diào)的lncRNAs。某些lncRNAs在PDLSCs中高表達(dá)，如NR 045555、NR 033651和NR 027621；另外一些則相比骨髓MSCs低表達(dá)，如NR 037182、NR 037595和XR 111050。作者還同時(shí)檢測(cè)了相關(guān)的mRNA表達(dá)情況，并用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建起一個(gè)lncRNAs-mRNA模型，分析發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs可能通過影響相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響了諸如凋亡、MAPK、Wnt等復(fù)雜的信號(hào)通路，最終影響到細(xì)胞的凋亡、增殖與分化過程，它們很可能也參與了MSCs的成骨分化進(jìn)程。

有報(bào)道稱MSCs細(xì)胞有致瘤傾向，Shoshani等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA H19高表達(dá)，則這種傾向更明顯，表明lncRNA H19可能在其成瘤分化中起到正向調(diào)控作用，它也可以成為MSCs致瘤過程中的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)；Liu等［26］的研究成果表明lncRNA HOTAIR也參與了表皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程。在骨髓瘤細(xì)胞向MSCs轉(zhuǎn)化過程中，lncRNA MALAT1可通過影響LTBP3基因表達(dá)參與了整個(gè)轉(zhuǎn)化過程［27］。這些研究一定程度上拓展了人們對(duì)lncRNAs在MSCs生物學(xué)功能影響方面新的認(rèn)識(shí)。

4 小結(jié)與展望

基因的經(jīng)典功能是編碼對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，但是占基因絕大部分的非蛋白編碼序列則是由包括micro RNAs、lncRNAs等在內(nèi)的調(diào)控序列組成。隨著二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷成熟，大量的lncRNAs被發(fā)掘出來，初期的研究成果已經(jīng)表明，lncRNAs參與了細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育等重要生命活動(dòng)的整個(gè)調(diào)控過程，并與人類的諸多重大疾病密切相關(guān)。DNA元件百科全書（encyclopedia ofDNA elements，ENCODE）計(jì)劃已經(jīng)在人類基因組中鑒定了9000余條lncRNAs，但其中具有明確生物學(xué)功能的僅有100條左右［28］，大量的基因“富礦”有待人類去開發(fā)。

相比其他細(xì)胞功能研究，lncRNAs在MSCs中的功能研究少之又少。但毋庸置疑，雖然前期研究僅停留在生物芯片與生物信息學(xué)分析層面，其強(qiáng)大的研究潛力已經(jīng)呈現(xiàn)出來。基于lncRNAs在生命領(lǐng)域的強(qiáng)大功能，隨著新的研究技術(shù)體系的建立，lncRNAs在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化、增殖、凋亡等重要生命活動(dòng)中的確切分子機(jī)制最終將得以闡釋。

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Progress on the regulate process of long non-coding RNA in osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cell

ZHAO Peiqing WANG Lianqing LITao
Department of Central Laboratory,Zibo Central Hospital,Shandong Province,Zibo 255036,China

Mesenchymal stem cell,one type of self-renewal and directed differentiation of stem cells,plays important roles in the tissue repair and cell growth.Recently,researchers have found thatmany long non-coding RNAs up and down regulated in the process ofmesenchymal stem cell development,which means it as an important regulatory point may plays important functions in the development ofmesenchymal stem cell.Although the researches are little focused on the functional studies,its potential prospect has been valued.

Mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Long non-coding RNA

R34

A[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]1673-7210（2015）06（c）-0035-04

2015-03-31本文編輯：蘇暢）

山東省自然科學(xué)基金（ZR2014HM042）。

趙培慶（1977.3-），男，碩士；研究方向：骨質(zhì)疏松相關(guān)免疫機(jī)制。

李濤（1970.6-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：骨質(zhì)疏松與骨礦鹽代謝。