岳肖一，耿召良，梁貴林，張長云，楊春元，葛永輝，汪 冶

(1.貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081； 3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001)

0 引言

20世紀(jì)60年代以來各國對煙制品焦油含量限制越來越嚴(yán)格，發(fā)展低焦油卷煙已成為世界煙草發(fā)展的必然趨勢.自2000年以來，全國卷煙焦油實(shí)測加權(quán)平均值年均降低0.42 mg/支，焦油含量得到有效控制，但也導(dǎo)致煙氣中的香味成分減少，導(dǎo)致卷煙香味不足[1]，使煙用香精香料開發(fā)及香味補(bǔ)償技術(shù)在當(dāng)前開發(fā)低焦油卷煙中非常重要[2].香氣是煙葉品質(zhì)的核心內(nèi)容，但游離態(tài)香味成分易揮發(fā)，留香不持久，釋放不均勻，因此潛香物質(zhì)引起了越來越多人的關(guān)注.潛香物質(zhì)(flavor precursors)又叫香味前驅(qū)體(precursor of flavor component)，是指本身沒有香味或香味不明顯，但在陳化或燃燒等過程中能夠降解產(chǎn)生香氣物的物質(zhì)[3].煙草中的潛香物質(zhì)在煙葉生長、調(diào)制、純化和燃燒過程中積累、轉(zhuǎn)化和降解，可直接影響煙草的香氣風(fēng)格和品質(zhì)，主要包括類胡蘿卜素類、西柏烷類、賴百當(dāng)類、含氮類及糖苷類等[4].

糖苷穩(wěn)定性良好，能在吸煙過程中或特定條件下(酶解、水解、高溫分解)分解釋放香氣成分，是煙葉中最重要前體之一[5-6].在美國，乙基香蘭素-β-D-吡喃葡萄糖苷被允許作為香料添加到香煙中用來改善煙氣[7].煙草中糖苷單體的分離鑒定和研究工作主要集中在20世紀(jì)70年代至80年代，近年來的研究也僅限于部分糖苷單體的穩(wěn)定性、熱裂解性及混合物添加價(jià)值研究，對于如何快速準(zhǔn)確地獲得糖苷標(biāo)準(zhǔn)品和其香氣釋放仍是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn).近些年來，許多研究者著重研究用更快更直接的方法分析糖苷鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)，以期發(fā)現(xiàn)潛在的香氣成分[8].本文對煙草中糖苷類化合物的制備、香氣釋放和應(yīng)用等進(jìn)行了綜述，為后續(xù)的煙草糖苷類物質(zhì)制備及添加研究提供指導(dǎo).

1 糖苷的性質(zhì)

糖苷廣泛分布于植物中，是植物中的重要次生代謝產(chǎn)物.糖苷在煙草植物體內(nèi)的含量比較低，新鮮煙葉糖苷類香味前體含量最高，在調(diào)制類型不同的煙草中，烤煙中的糖苷結(jié)合態(tài)香味成分含量最高[9-10],煙草中部煙葉的含量明顯高于上部、下部煙葉[11].

糖苷(glucoside)是環(huán)狀糖的半縮醛羥基與另一分子化合物中的羥基、氨基等失水生成的失水產(chǎn)物，也稱為配糖體[12]，是糖或糖的衍生物與配基通過苷鍵鏈接形成的化合物，見圖1.

圖1 糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structural diagram of glycoside

煙草中糖苷類潛香物質(zhì)的配基大多具有香氣，主要有：萜烯類、C13-降異戊二烯類、苯及苯的衍生物、羥基酯類、己醇己烯醇類[13].糖基一般為單糖或雙糖，三糖較少[14].這些糖苷類化合物前體一般為對應(yīng)的具有芳香性的醇類化合物，在燃燒、酶解過程中，隨糖苷鍵的斷裂釋放香味成分[15].

糖苷化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及性質(zhì)有很多分類方法，煙草中糖苷的分類多根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行多種分類方法交叉應(yīng)用，其中苷鍵原子和糖的數(shù)目是應(yīng)用最多的分類方法.按苷鍵原子的不同，可分為O-苷、C-苷、N-苷、S-苷；按糖的數(shù)目的不同，可分為單糖苷、低聚糖苷.

2 糖苷的制備方法

2.1 色譜法

國內(nèi)外研究者已從不同烤煙中分離了多種糖苷單體，見表1，包括單糖苷和雙糖苷，大部分為葡萄糖苷，從晾曬煙中分離糖苷的研究鮮有報(bào)道.利用色譜法能獲得煙草中未知及通過合成手段不成功的糖苷，且純度較高(多在90%以上)，但本法難度高，實(shí)驗(yàn)周期長.煙草中糖苷的分離為煙草香氣的形成、煙草品質(zhì)的評價(jià)提供了新的思路.

表1 從煙草中分離的部分糖苷類化合物

從煙葉中通過色譜法分離糖苷的過程為溶劑提取、萃取、色譜法分離、高效液相色譜(HPLC)純化富集，見圖2.糖苷極性較大，溶解度也根據(jù)苷元的性質(zhì)而有較大的差異[23].根據(jù)相似相溶原理，用水或醇等強(qiáng)極性溶劑浸泡或加熱回流濃縮后獲得煙草浸膏[24].糖苷在酸性條件下發(fā)生水解，因此不建議用酸堿萃取法而是采用有機(jī)溶劑萃取法去除干擾成分.得到的浸膏利用各種常規(guī)分離手段(薄層色譜、柱色譜、重結(jié)晶等)得到糖苷細(xì)提物.使用高效液相色譜輔助分離獲得糖苷類化合物的單體，并借助MS及NMR等波譜數(shù)據(jù)鑒定其苷元和糖基部分.

本課題組開展了貴州烤煙糖苷的分離鑒定，在研究過程中糖苷單體含量少，大量的煙堿干擾是分離純化糖苷的難點(diǎn).實(shí)驗(yàn)過程中，糖苷組分的富集十分的重要.在糖苷定性定量研究中，采用固相萃取技術(shù)，用水洗和酸洗對去除生物堿的干擾的效果較好[25]，這為去除煙堿干擾提供了研究思路.目前該法應(yīng)用于糖苷分離制備中，酸堿度難以控制、成本較高、適用樣品量較小.

圖2煙草糖苷分離流程示意圖

Fig. 2Flowdiagramofglycosideisolatedfromtobacco

2.2 有機(jī)合成法

通過有機(jī)合成法制備糖苷的研究始于1893年[26]，至今已有100多年的歷史，化學(xué)合成糖苷容易控制條件而且可以廣泛地應(yīng)用到生產(chǎn)中，由于糖自身結(jié)構(gòu)中存在著多個羥基和縮醛結(jié)構(gòu)，使得糖苷的合成具有復(fù)雜性[27].糖苷的合成方法有：Fischer法、Koenings-Knorr法、相轉(zhuǎn)移催化法、硫苷法、三氯乙酰亞胺酯法、Helferich法、4-戊烯法、原酸酯法、磷酸酯糖作為糖基供體等方法.其中應(yīng)用Fischer法、Koenings-Knorr法、相轉(zhuǎn)移催化法合成糖苷最為常見.

2.2.1 Fischer法

Fischer法合成糖苷的原理是低分子糖與醇在酸性催化劑(硫酸、對甲苯磺酸、烷基苯磺酸、磺酸樹脂等)作用下反應(yīng)生成烷基糖苷.Fischer法優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件簡單、收率高，缺點(diǎn)是產(chǎn)物為多種異構(gòu)體的混合物.合成方法的關(guān)鍵是催化劑的選擇，新型催化劑的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)，固體超強(qiáng)酸催化劑SO42-/TiO[28]、己內(nèi)酰胺-對甲苯磺酸離子液體[29]，都能以較高收率合成烷基糖苷.

2.2.2 Koenings-Knorr法

Koenings-Knorr法合成糖苷的原理是鹵代(溴、氯代)糖與醇在重金屬鹽(銀鹽、汞鹽)作催化劑條件下反應(yīng)生成氧苷.該法優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物結(jié)構(gòu)專一、收率較高，缺點(diǎn)是反應(yīng)條件苛刻、催化劑較貴.目前已經(jīng)成功合成出龍腦莰醇葡萄糖苷、馬鞭草烯醇葡萄糖苷[30]、ɑ-紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷[31]等有香氣的配基糖苷.氟代糖[32]和碘代糖[33]作為糖基供體為傳統(tǒng)Koenings-Knorr法合成糖苷提供了新思路.

2.2.3 相轉(zhuǎn)移催化法(Phase transfer catalyst，PTC)

相轉(zhuǎn)移催化法合成糖苷的原理是溴代糖與酚、醇溶解在二氯甲烷與堿性溶液中在相轉(zhuǎn)移催化劑條件下合成糖苷，產(chǎn)物為硫苷、氧苷等[34].相轉(zhuǎn)移催化劑大多采用季銨鹽，有四丁基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、三乙基芐氧基氯化銨[35].該法優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、收率較高、立體選擇性好[36]，缺點(diǎn)是反應(yīng)物不穩(wěn)定，催化劑用量較多[37].目前已經(jīng)成功合成出丁香基-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷、異丁香基-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷[38]、乙基香蘭素葡萄糖苷[39].

產(chǎn)物專一的Koenings-Knorr法和相轉(zhuǎn)移催化法都已經(jīng)成功合成出具有潛香價(jià)值的糖苷，利用有機(jī)合成法制備糖苷建議采用相對經(jīng)濟(jì)的相轉(zhuǎn)移催化法.但目前沒有一種簡單有效的方法可以綠色化、高收率地合成目標(biāo)糖苷.各種糖苷合成方法應(yīng)相互借鑒思路，如在Koenings-Knorr法上發(fā)展的硫苷法[40]，找到一種行之有效立體選擇性好的合成方法，是未來研究化學(xué)合成糖苷的重點(diǎn).

1913年，Bouquelot提出利用高效、具有立體選擇性的酶作為催化劑合成糖苷，生物催化法合成糖苷優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和、可以得到高度選擇性的產(chǎn)物，缺點(diǎn)是酶的使用壽命短、產(chǎn)物復(fù)雜[41-43].不同活性中心的酶作為催化劑，會表現(xiàn)出不同的反應(yīng)原理和催化能力.常用的酶有：糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶、糖苷合成酶等.立體選擇性好、產(chǎn)率高、經(jīng)濟(jì)的糖苷合成酶法是制備糖苷的新選擇.目前利用糖苷酶已經(jīng)成功合成出橙花醇糖苷[44]、薄荷醇糖苷[45]等具有潛香價(jià)值的糖苷.目前已知的糖苷酶有2500種[46]，但是深入研究的生物酶卻很少，利用生物手段合成糖苷有巨大的開發(fā)潛力.

3 糖苷的香味釋放

在燃吸過程中糖苷能夠均勻地增加香氣是因?yàn)檐赵木徛尫臶47]，裂解是卷煙燃燒過程的一個重要環(huán)節(jié).熱分析方法是研究糖苷香味前體熱裂解和香味釋放的有效手段[48]，了解糖苷類香味前體的裂解方式、裂解產(chǎn)物有助于其在高溫產(chǎn)品、卷煙加香的應(yīng)用.目前大多數(shù)熱裂解分析研究針對糖苷單體化合物，一般采取無氧在線裂解或高溫熔鹽法離線裂解等手段對糖苷進(jìn)行熱裂解，利用氣相色譜-質(zhì)譜儀定性定量分析熱解產(chǎn)物.通過研究發(fā)現(xiàn)糖苷裂解主要是從糖苷鍵處斷裂，從而釋放出豐富的酮類、醇類、酚類有機(jī)酸等致香成分.裂解溫度的選擇對裂解產(chǎn)物的組成至關(guān)重要，不同糖苷最佳裂解溫度差異很大，300 ℃左右是適合香葉基葡糖苷裂解的溫度(玫瑰花香)[49]，香蘭素-α-D-葡糖苷在600 ℃下產(chǎn)生的大量的香味成分(甜味奶香)[50]，薄荷醇糖苷釋放葉醇的最佳溫度是350 ℃[51].控制降解溫度可以得到較多的香氣物質(zhì)也可使香氣質(zhì)量更加豐滿.

4 糖苷的應(yīng)用

近年來，隨著消費(fèi)者對卷煙制品安全性要求的提高，降低焦油含量、提高香氣、降低危害成為煙草行業(yè)研究的熱點(diǎn)[52].糖苷類潛香物質(zhì)作為重要的一類香味補(bǔ)償物質(zhì)，引起了廣大研究者研究.通過加樣濃度分析、主流煙氣香味成分分析、糖苷穩(wěn)定性分析、逐口釋放分析、感觀特征評價(jià)研究表明糖苷可使卷煙香氣增加，降低刺激性，提升卷煙品質(zhì)(表 2).香蘭素糖苷、紫羅蘭醇糖苷、香葉醇糖苷對于卷煙加香應(yīng)用研究的最深入.但目前只有乙基香蘭素-β-D-葡萄糖苷是唯一通過美國FEMA組織評估并允許作為香料使用的糖苷化合物[53].

糖苷類潛香物質(zhì)在燃吸過程中可以逐漸釋放香氣物質(zhì).但在裂解過程中糖苷鍵、糖的斷裂產(chǎn)生了苯酚、對苯二酚等揮發(fā)性的酚類、多環(huán)芳烴等卷煙煙氣中的有害成分.雖然糖苷類潛香物質(zhì)能夠修飾香氣提升卷煙品質(zhì)，但酚類、多環(huán)芳烴的含量的提高限制了其在卷煙工業(yè)中的應(yīng)用[54].因此安全性是能夠?qū)⑵溥\(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)的未來研究熱點(diǎn).

表2 評吸效果較好的部分糖苷類化合物

5 結(jié)論

通過糖苷制備方法的比對，可以看出：色譜法獲得糖苷立體選擇性差、難度高、實(shí)驗(yàn)周期長.生物酶促法合成糖苷酶的使用壽命短、產(chǎn)物復(fù)雜.而有機(jī)合成法由于條件容易控制、立體選擇性好，因此有機(jī)合成法尤其是相轉(zhuǎn)移催化法是推薦的制備糖苷的方法.

煙草中糖苷的香味釋放有熱裂解、酶水解等方式，但酶解法在實(shí)際應(yīng)用較少.通過熱裂解產(chǎn)物分析，在高溫時(shí)糖苷鍵的斷裂是最主要的裂解原理，從而使糖苷配體與糖基分開，釋放出豐富的酮類、醇類、酚類、有機(jī)酸等致香成分.因此在煙草行業(yè)中，深入研究配體有香味的糖苷的最佳裂解溫度、裂解時(shí)間、裂解協(xié)同性對發(fā)現(xiàn)香味補(bǔ)償劑具有指導(dǎo)意義.

在加香評吸研究中，控制添加含量以及降低隨之引發(fā)的有害煙氣，是解決其在卷煙工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵問題.

研究更快速有效制備糖苷的方法，擴(kuò)大在卷煙加香試驗(yàn)中加入糖苷的種類和研究范圍.并結(jié)合生物化學(xué)、天然藥物化學(xué)、微生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科交叉滲透以及現(xiàn)代儀器分析手段的發(fā)展，對發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性好加香減害并能在卷煙工業(yè)生產(chǎn)中廣泛地應(yīng)用的糖苷類潛香物質(zhì)是今后糖苷研究的主要方向，其應(yīng)用前景十分廣闊.