梁文思　劉志媛

摘 要 為研究培養(yǎng)溫度對底棲硅藻雙眉藻（Amphora sp. HN08）比生長速率和脂肪、蛋白及多糖等細(xì)胞主要成分的影響，將雙眉藻培養(yǎng)于25、30、35和38℃四 個溫度條件下，6 d后測定細(xì)胞的比生長速率、總脂、可溶性蛋白和總糖的含量。結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度對雙眉藻的生長和細(xì)胞主要成分含量有顯著影響。雙眉藻在38℃條件下生長最快，但總脂含量僅為細(xì)胞干重的12.9%；30和35℃培養(yǎng)條件下細(xì)胞油脂積累量最多，分別達(dá)到細(xì)胞干重的44.8%和44.1%；培養(yǎng)于20℃條件下藻細(xì)胞的可溶性蛋白和總糖含量顯著高于其他處理，但細(xì)胞的比生長速率顯著低于其他溫度條件。

關(guān)鍵詞 雙眉藻 ；溫度 ；脂 ；蛋白 ；糖

分類號 X703.1 ；S949

Abstract Effects of cultural temperature on the specific growth rate and the main components including lipids， proteins and carbohydrates in diatom Amphora sp. HN08 cells were studied. The benthic diatom was cultured under four levels of temperature： 25℃， 30℃， 35℃ and 38℃. The specific growth rate， total lipids content， total carbohydrates content and soluble protein content were determined after 6 days of culture. Our results indicated that the culture/cultural temperature had a significant influence on the growth rate and the main cell components of A sp. HN08. The maximum specific growth rate of A sp. HN08 was observed under 38℃. While total lipids content of cells cultured under 38 ℃ was only 12.9% by dry weight. 30℃ and 35℃ cultural conditions contributed to lipid accumulation， under which the lipid content reached to 44.8% and 44.1% by dry weight， respectively. The content of soluble protein and total carbohydrate in cells cultured under 20℃ were significantly higher than that under other cultural conditions， while the growth rate under 20℃ was significantly lower than that under other temperature conditions.

Keywords Amphora sp. HN08 ； temperature ； lipid ； protein ； carbohydrates

微藻是一類體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速的單細(xì)胞光合自養(yǎng)生物，長期以來被用作魚、蝦、貝類幼體或成體的直接或間接的活餌料。由于微藻細(xì)胞可以合成和積累一些高附加值的初級和次級代謝物，在食品、化妝品及醫(yī)療保健品等領(lǐng)域具有較大的開發(fā)潛力[1-2]。在能源領(lǐng)域，含油量高的藻種被人們認(rèn)為是最有潛力的第3代生物燃料，從微藻中制取生物燃油成為近年來人們研究的熱點(diǎn)[3-4]。

微藻感知環(huán)境和適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)，當(dāng)環(huán)境信號改變后，細(xì)胞就會通過改變自身代謝的方式適應(yīng)環(huán)境變化，自身的代謝產(chǎn)物也會發(fā)生相應(yīng)的變化。蛋白質(zhì)、碳水化物和脂是微藻光合作用的主要同化物質(zhì)，其含量和比例也是評價其餌料價值或生物燃油原料潛力的重要指標(biāo)之一，是微藻產(chǎn)品開發(fā)的重要依據(jù)。研究表明，3種碳基化合物的含量和比例受環(huán)境因子（如溫度、氮、磷、硅、鐵等營養(yǎng)鹽）調(diào)控[5-11]，在生產(chǎn)過程中，人們可以通過調(diào)控環(huán)境因子來獲得最高產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，如油脂、蛋白或色素，同時通過微藻精煉技術(shù)收獲其他高附加值的物質(zhì)。因此，了解環(huán)境條件對微藻主要代謝物質(zhì)的影響，是藻類開發(fā)利用的前提。

我們在海南海域分離的熱帶硅藻——雙眉藻（Amphora sp. HN08），其含油量高（30%左右），適應(yīng)性強(qiáng)，具有生產(chǎn)生物燃油的潛力；經(jīng)海參養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該種硅藻還是糙刺參（Stichopus horrens）喜食的餌料。本研究以這株雙眉藻為材料，研究不同溫度條件（20、30、35及38℃）對藻細(xì)胞的油脂、可溶性蛋白和總糖3種主要同化物含量的影響，以及溫度對比生長速率的影響，優(yōu)化溫度培養(yǎng)條件，為該株微藻的生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雙眉藻分離自?？谑邪咨抽T海域。以f/2培養(yǎng)基[12]單藻種靜止培養(yǎng)。室溫（27±2）℃，光周期為14 h∶8 h，光照4 000 lx，培養(yǎng)期間每天定時搖瓶3次。

取指數(shù)生長期藻液，按1∶5比例接種于3 L 玻璃三角瓶中。搖勻后分裝于250 mL三角瓶中，每瓶200 mL藻液。海水取自?？谑邪咨抽T，鹽度30‰，pH8.1。過濾后高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個處理：20、30、35、38℃，每個處理3個重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 生長測定

雙眉藻培養(yǎng)6 d后離心（5 000 g，Sigma 3-30K）收集，去離子水清洗一次，再次離心獲得藻細(xì)胞沉淀。藻細(xì)胞冷凍干燥（Labconco）后以精密分析天平（MA200，上海良平儀器儀表有限公司）稱重。據(jù)以下公式計(jì)算雙眉藻的比生長速率（K）和細(xì)胞倍增時間：

K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1）（1）

T=0.693 1/K（2）

式中，K為相對生長速率，t1、t2 為對應(yīng)的培養(yǎng)時間（3 d），N1和N2分別為t1、t2 時期的細(xì)胞干重，T為細(xì)胞的平均倍增時間。

1.2.2 總脂、總糖和可溶性蛋白分析

細(xì)胞中的總脂用氯仿/甲醇（2/1， v/v）抽提，按照Bligh和 Dyer方法[13]測定細(xì)胞總脂含量；考馬斯亮藍(lán)染色法測定細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)含量[14]；硫酸蒽酮法測定細(xì)胞總糖濃度[15]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析[16]，采用Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對雙眉藻生長的影響

隨培養(yǎng)溫度升高，雙眉藻細(xì)胞倍增時間縮短。38℃時雙眉藻生長最快，比生長率是20℃時的2.8倍。雙眉藻在30和35℃時的生長速率無顯著差異，均顯著低于38℃的，而高于20℃的（p<0.05）。見表1。

2.2 溫度對雙眉藻細(xì)胞中總脂、總糖和可溶性蛋白含量的影響

30和35℃的溫度條件最有利于雙眉藻油脂的積累，總脂含量達(dá)到細(xì)胞干重的40%以上；38℃高溫條件不利于雙眉藻細(xì)胞油脂的積累，總脂含量只占細(xì)胞干重的12.9%，僅為30℃培養(yǎng)的藻細(xì)胞的29%，顯著低于其他3個溫度組（p<0.05）。見表2。

20℃低溫培養(yǎng)的藻細(xì)胞的可溶性蛋白和總糖含量均顯著高于其他處理（p<0.05），可溶性蛋白和總糖含量分別為細(xì)胞干重的12.2%和4.5%。30、35和38℃培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞的可溶性蛋白和總糖含量無顯著差異（p>0.05）。

3 討論與結(jié)論

海洋底棲硅藻雙眉藻（Amphora ssp.）是鮑魚、海參和海膽等名貴水產(chǎn)動物苗種生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)餌料[17-20]。此外，該藻富含油脂和巖藻黃素，其底棲生長特性可使細(xì)胞采收脫水的成本比一般浮游微藻藻類低，因此具有生物燃油或保健品生產(chǎn)開發(fā)的潛力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對海南海域篩選的雙眉藻HN08的細(xì)胞繁殖速率以及油脂、蛋白和糖等同化物的含量均有顯著影響。

生長速率是衡量微藻應(yīng)用價值的重要指標(biāo)之一。研究結(jié)果表明，在20～38℃溫度范圍內(nèi)，雙眉藻HN08的比生長速率隨溫度的升高而增加，38℃靜止培養(yǎng)條件下的比生長速率顯著高于其他溫度條件下的，為0.36 d-1。錢振明[8]等對8種底棲硅藻的研究結(jié)果表明，在15～25℃時，8種底棲硅藻的比生長率最大，超過30℃不利于藻類的生長。郭峰等[21]研究表明，分離自海南海區(qū)的兩種熱帶底棲硅藻亞歷山大菱形藻（Nitzschia alexandrina）和矮小卵形藻（Cocconeis diminuta）的最適溫度為30℃；黃海立等[22]測定了簡單雙眉藻（Amphora exigua）生長的最適溫度為28～31℃。周一春等[20]測得從西沙永興島附近海域分離的雙眉藻（Amphora sp.）的最適生長溫度為25～30℃。通過比較可知，本實(shí)驗(yàn)藻株是一株較耐高溫的底棲硅藻。

微藻將光合作用固定的碳用于合成糖、蛋白和脂肪等物質(zhì)，參于細(xì)胞的生長代謝。許多研究認(rèn)為，糖和蛋白含量在最適生長溫度下達(dá)到最大含量[8，23]；但脂肪含量的變化較復(fù)雜。一般認(rèn)為，微藻在不良環(huán)境下才會啟動脂肪的大量合成和積累[24]。周洪琪等[25]對新月菱形藻和鏟狀菱形藻的研究表明，總脂含量與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在溫度較低時，細(xì)胞內(nèi)的脂肪傾向于以多不飽和脂肪酸的形式存在，以維持細(xì)胞膜的流動性；而飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸則隨溫度升高而增多[26]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對熱帶硅藻雙眉藻HN08細(xì)胞主要成分的影響與前人的研究結(jié)果不同。20℃條件下，雙眉藻HN08的比生長速率顯著低于其他處理，細(xì)胞倍增時間是38℃條件下的近3倍，這表明20℃并非雙眉藻的最適生長溫度。但在此低溫條件下，細(xì)胞中的總糖和可溶性蛋白的含量達(dá)到了各處理溫度條件下的最大值，而總脂的積累量卻在30～35℃的適宜生長的溫度條件下達(dá)到最高值。這可能是與藻種間的代謝差異有關(guān)。硅藻的貯藏物質(zhì)主要是油脂。適溫條件下細(xì)胞的光合碳同化速率最高，由此增加了光合產(chǎn)物（如糖等有機(jī)化合物）的量，最終使得細(xì)胞內(nèi)的貯藏碳基化合物脂的積累量也增加。低溫條件下，細(xì)胞生長增殖緩慢可能是同化物質(zhì)積累的主要原因。38℃高溫條件最有利于微藻細(xì)胞的分裂和生長，但3種同化物質(zhì)含量都不高，尤其是總脂含量顯著低于其他溫度處理，可能是高溫條件下細(xì)胞生長代謝速率加快，從而減少了貯藏物質(zhì)的含量。

大量研究表明，微藻通常具有在逆境條件下積累油脂的特性，單細(xì)胞油脂含量的增加往往伴隨著藻細(xì)胞生物質(zhì)產(chǎn)量的下降，從而影響油脂最終產(chǎn)量[27-28]。本研究表明，熱帶硅藻雙眉藻HN08在30～35℃條件下的細(xì)胞油脂含量達(dá)到最高值，細(xì)胞生長繁殖也未受到抑制，可以獲得最高的油脂產(chǎn)量，因而具有生產(chǎn)生物燃油的潛力。

溫度是影響微藻生命活動的重要因素之一，通過調(diào)控溫度，可改變微藻細(xì)胞生長增殖和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在生產(chǎn)上，可以首先給予藻細(xì)胞生長的最適溫度條件，待培養(yǎng)藻細(xì)胞達(dá)到最高生物質(zhì)產(chǎn)量后，根據(jù)藻種生物學(xué)特性改變溫度條件，從而獲得最高的目的產(chǎn)物產(chǎn)量。

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