周進(jìn)文

(黑龍江省大西江農(nóng)場畜牧科,黑龍江黑河 161448)

奶牛腸道致病性沙門氏菌的分離與鑒定

周進(jìn)文

(黑龍江省大西江農(nóng)場畜牧科,黑龍江黑河 161448)

奶牛沙門氏菌病是指奶牛受到沙門氏菌屬細(xì)菌所感染而導(dǎo)致奶牛受到傳染而發(fā)生疾病。常見的奶牛受到沙門氏菌感染后所引起的癥狀有:奶牛敗血癥、奶牛胃腸炎以及懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)等等。本試驗(yàn)為調(diào)查研究黑龍江省九三管理局某牛場沙門氏菌的流行情況,對黑龍江省九三管理局某奶牛場出現(xiàn)疑似癥狀的奶牛進(jìn)行采取腸道新鮮糞便進(jìn)行了致病性沙門氏菌的分離與鑒定。

奶牛沙門氏菌病;沙門氏菌屬細(xì)菌;分離

1 材料與方法

1.1 材料

糞樣：取自黑龍江省九三管理局某奶牛場疑似感染沙門氏菌的荷斯坦泌乳奶牛的直腸糞便。

培養(yǎng)基：DHL 瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯、SS 瓊脂、三糖鐵培養(yǎng)基。

革蘭氏染色試劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液；革蘭氏碘液；沙黃水溶液；碳酸品紅溶液。

1.2 方法

糞樣的采集：從試驗(yàn)牛的肛門采集直腸糞樣，將采集的新鮮糞樣分別裝入無菌三角瓶立即送實(shí)驗(yàn)室。

致病菌培養(yǎng)：

預(yù)增菌培養(yǎng)：無菌稱取樣品 25.0g，加入蛋白胨水225ml，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)18 h。

選擇性增菌培養(yǎng)：取預(yù)增菌0.1ml，接種含有 10 ml MeCl2—MM的培養(yǎng)管當(dāng)中，培養(yǎng)溫度設(shè)置為42 ℃，培養(yǎng)時間為 24 h；另外選取預(yù)增菌培養(yǎng)物 10ml，接種于含有 100ml SC培養(yǎng)管當(dāng)中，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 1～2d。

純化培養(yǎng)：?。∕M）和（SC）增菌液，分別劃線接種于DHL 瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 18h～24h，選取單克隆菌種，純化培養(yǎng)。純化的可疑菌落接種普通瓊脂斜面，置于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 18 ～24 h，于4℃冰箱當(dāng)中保存?zhèn)溆谩?/p>

致病菌的鑒定：

鏡檢：從 DHL 瓊脂平皿培養(yǎng)物上挑取單個可疑菌落，涂片、革蘭氏染色，鏡檢。

生化鑒定：純培養(yǎng)后的菌株接種于普通肉湯中 37℃培養(yǎng)18h～24 h 后，吸取 1～2 滴的肉湯培養(yǎng)物加入各種微量生化管內(nèi)，37℃培養(yǎng) 24h～48h，觀察結(jié)果。

血清型鑒定：采用玻片凝集法。在玻片上用少量生理鹽水稀釋普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純化菌落至懸液呈均勻的乳白色，首先滴加 1 滴沙門氏菌 A－F 多價血清與之混合均勻，觀察結(jié)果；然后，用各群 O 抗原因子血清，即 O2（A 群）、O4（B 群）、O7（C1 亞群）、O8（C1 亞群）、O9（D4 群）、O5，O10（E群）、O11（F 群）對被檢菌逐個進(jìn)行凝集試驗(yàn)檢查，確定其 O抗原組成。同時，以標(biāo)菌株做陽性對照、滅菌生理鹽水代替多價血清做陰性對照，實(shí)驗(yàn)方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌培養(yǎng)特性

分離的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用普通營養(yǎng)肉湯時，出現(xiàn)渾濁且有少量的沉淀出現(xiàn)。

于常規(guī)普通的營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，長勢良好，菌種形態(tài)為：略微凸起、表面光滑、呈圓形；顏色為：半透明，或者呈現(xiàn)出灰白色；菌種之間排列較為緊密，而且大小均勻。

將分離的菌株培養(yǎng)于 SS 瓊脂后發(fā)現(xiàn)，菌落形態(tài)為：菌落性狀均一，呈圓形狀態(tài)，略微凸起，菌落中央呈現(xiàn)出黑色

將分離得到的菌種培養(yǎng)于 DHL 瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：菌落狀態(tài)為：無色半透明，產(chǎn)生H2S菌落的中心呈現(xiàn)為黑色；而乳糖呈現(xiàn)陽性的菌株的顏色呈現(xiàn)為：粉紅色，且?guī)в泻谏粚⑵溥M(jìn)一步接種 TSI 斜面，產(chǎn)生如表 1結(jié)果的菌落判為疑似菌，傳代純化后進(jìn)一步做生化鑒定和血清型鑒定。

表1 沙門氏菌三糖鐵（TSl）培養(yǎng)基生長判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.2 形態(tài)學(xué)特性

涂片、革蘭氏染色鏡檢為兩端鈍圓、革蘭氏陰性短小桿菌。如圖1

圖1 沙門氏菌革蘭氏染色

2.3 生化鑒定結(jié)果

將分離得到的菌株置于生化管當(dāng)中于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為 1～2 d，觀察，并記錄結(jié)果。三糖鐵斜面的顏色為紅色，底部呈黃色略變黑。沙門氏生化鑒定結(jié)果：H2S、丙二酸鹽為大多數(shù)菌株陽性/少數(shù)陰性；靛基質(zhì)、尿素、KCN、水楊素、吲哚、ONPG為陰性；賴氨酸脫羧酶、山梨醇、甘露醇、衛(wèi)矛醇、木糖、硝酸鹽、葡萄糖、枸櫞酸鹽均為陽性；

2.4 血清型鑒定

所采取樣品進(jìn)行培養(yǎng)之后的培養(yǎng)液與用于鑒定的血清在2分鐘內(nèi)發(fā)生凝集即為陽性，相反則為陰性。各群中 B 群沙門氏菌最為普遍，占 50.0%（4/8），其次為 D 群沙門氏菌、C1 群沙門氏菌、A 群沙門氏菌，各占 12.5%（1/8）、25%（2/8）、12.5%（1/8）

3 討論

對疑似沙門氏菌的菌種進(jìn)行血清型鑒定實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在同一個牛場當(dāng)中所感染的沙門氏菌得血清型就有多種，說明沙門氏菌血清型的復(fù)雜性。此外，對沙門氏菌研究較為普遍的報道一般以牛流產(chǎn)沙門氏菌的分離鑒定為主。因此，調(diào)查該地區(qū)牛場當(dāng)中沙門氏菌的血清型以及流行情況，不但為牛場沙門氏菌病的防制，提供了理論基礎(chǔ)以及科學(xué)依據(jù)，此外該措施無疑將為控制沙門氏菌污染食品奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)對疑似感染沙門氏菌的奶牛進(jìn)行采樣分析，對其直腸內(nèi)糞便內(nèi)菌群進(jìn)行分離鑒定，對所分離出的菌種的形態(tài)特征、染色結(jié)果、培養(yǎng)特性、三糖鐵瓊脂板上的生長形態(tài)特征，從九三管局某牛場當(dāng)中出現(xiàn)疑似感染沙門氏菌共 4 頭成年泌乳荷斯坦奶牛直腸新鮮糞便中初步分離到 4 株沙門氏菌。通過觀察這幾株菌落的生長狀態(tài)、生化試驗(yàn)、血清型鑒定等試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，4 株沙門氏菌為致病性沙門氏菌，其血清型有A 群、B 群、C1亞群、D4 群。而奶牛在受到沙門氏菌感染時，主要的致病性沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌以及都柏林沙門氏桿菌。奶牛在被沙門氏菌所感染之后通常表現(xiàn)出胃腸炎、敗血癥、懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)等癥狀。為此，在畜牧業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐中對牛舌環(huán)境質(zhì)量的控制無疑將成為首要任務(wù)，同時更應(yīng)該要高度注意奶牛的環(huán)境衛(wèi)生，并采用綜合性疾病防治措施，此舉，無疑對保障畜牧業(yè)的發(fā)展以及畜牧經(jīng)濟(jì)動物健康具有重要的意義。

[1] 吳美云.奶牛腸道沙門氏菌的分離鑒定、對機(jī)體內(nèi)分泌的影響和體外抑制研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.