馬海波?。ㄟ|寧省桓仁縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心　117200）

本溪地區(qū)豬藍(lán)耳病的免疫及感染情況調(diào)查

馬海波（遼寧省桓仁縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心117200）

豬繁殖與呼吸綜合癥（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種免疫抑制性疾病。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由PRRSV變異株引起的一種急性高致病性傳染病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率高達(dá)50%，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%，育肥豬也可發(fā)病死亡。豬藍(lán)耳病可造成豬的免疫抑制，導(dǎo)致其他病菌、病毒趁虛而入，引發(fā)多重感染，繼而導(dǎo)致豬的免疫抑制進(jìn)一步加劇，最終導(dǎo)致大量豬死亡，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失

1　藍(lán)耳病的基本情況

1.1流行及癥狀藍(lán)耳病傳入我國(guó)的時(shí)間不長(zhǎng)。1995年從加拿大引進(jìn)的種豬分離到PRRS病毒，1995年底華北地區(qū)豬場(chǎng)暴發(fā)，傳播的速度非?？?。1996～1998年我國(guó)出現(xiàn)流產(chǎn)風(fēng)暴。1998年后，總體比較平穩(wěn)緩和，呈零星暴發(fā)。高致病性藍(lán)耳病疫病多發(fā)生于春末、夏初之高溫季節(jié)，特別是在飼養(yǎng)環(huán)境惡劣，豬舍通風(fēng)降溫不良，炎熱潮濕，飼養(yǎng)密度過(guò)大的散養(yǎng)戶和小型豬場(chǎng)多發(fā)。被感染的豬呈現(xiàn)出的臨床癥狀包括：高熱（41～42℃），精神沉郁，食欲減退，臥地不起，皮膚發(fā)紅，眼結(jié)膜炎、眼瞼水腫；氣喘、流鼻涕、咳嗽等呼吸癥狀；便秘、腹瀉等消化系統(tǒng)紊亂；部分豬后軀無(wú)力，不能站立或共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀

1.2豬藍(lán)耳病的危害一是使豬群的生產(chǎn)性能下降。二是豬瘟、偽狂犬、附紅細(xì)胞體、鏈球菌、斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥、呼吸道疾病發(fā)病率上升，三是母豬發(fā)情障礙、滯后產(chǎn)現(xiàn)象增多。使免疫系統(tǒng)損害，免疫功能下降，易繼發(fā)附紅細(xì)胞體病、鏈球菌病、沙門(mén)氏菌病等，與其他病原（支原體、PCV-2、豬瘟、偽狂犬、流感等）形成多重感染，影響豬瘟疫苗的免疫效果。

1.3傳播途徑可通過(guò)多種途經(jīng)傳播，呼吸道是該病的主要感染途經(jīng)，無(wú)臨床癥狀而帶毒豬可以傳播本病，并可垂直傳播。感染來(lái)源主要是：公豬精液、引種帶毒、豬射針頭、進(jìn)入豬場(chǎng)的人和物、蚊蠅傳播、運(yùn)輸車輛。持續(xù)感染或隱性感染非常普遍。豬持續(xù)性，隱性感染、帶毒，很難清除；是導(dǎo)致呼吸道疾病突出的根本原因，是原發(fā)性感染的病原體；感染豬場(chǎng)在沒(méi)有繼發(fā)感染的情況下，豬群一般不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀。單憑臨床表現(xiàn)很難確診。少有急性表現(xiàn)，以慢性、亞臨床性為主，常表現(xiàn)為繁殖與生產(chǎn)性能下降，豬難養(yǎng)，易患?。簧l(fā)性晚期流產(chǎn)。冬春季節(jié)易出現(xiàn)初產(chǎn)母豬繁殖障礙和晚期流產(chǎn)，經(jīng)產(chǎn)母豬不時(shí)出現(xiàn)流產(chǎn)；常規(guī)的防控方法很難奏效。我國(guó)藍(lán)耳病流行毒株已出現(xiàn)一些基因缺失的變易毒株。

2　調(diào)查材料與方法

2.1調(diào)查材料（1）取樣：從32個(gè)商品代養(yǎng)殖場(chǎng)、54個(gè)散養(yǎng)戶、16個(gè)種豬場(chǎng)共采集豬血樣品1530份，分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆茫粡?個(gè)屠宰場(chǎng)采集豬組織樣品80份，-20℃凍存?zhèn)溆?。?）試劑；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒，4℃冰箱保存；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒，-20℃冰箱保存。（3）主要儀器及器材：精密移液器、酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、熒光定量、PCR儀（北京生科尚儀公司）、生物安全柜、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電泳槽、紫外凝膠成像儀、組織研磨器。（4）檢測(cè)方法：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、抗體檢測(cè)分別采用RT-PCR、間接ELISA方法。

2.2方法 （1）抗體檢測(cè)（ELISA）：①包被：用0.05M pH9碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。②加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1h。然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。③加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1h，洗滌。④加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30min。⑤終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。（2）結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。（3）抗原檢測(cè)（RT-PCR）：①稱取豬組織0.5g于研磨器中，加少量的石英砂進(jìn)行研磨，再加入1.5mlpH值為7.2的PBS液研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，加入300μl變性液，混勻；取血清100μl置1.5mlEP管中，加入300μl變性液，混勻。取已處理的樣品，分別做好標(biāo)記，每管依次加入醋酸鈉溶液（pH值為4.0）30μl，酚/氯仿/異戊醇混合液300μl，顛倒10次，混勻，置-20℃冰箱中10min，4℃離心，12000R/S，離心15min。取300μl上清液置于1.5mlEP管中，加入300μl異丙醇，混勻，置-20℃冰箱中30min。取出置離心機(jī)中4℃離心，12000R/S離心20min。棄上清液，沿管壁緩緩滴入1ml75%乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，自然風(fēng)干（以無(wú)乙醇味為準(zhǔn)）。將DEPC處理的滅菌去離子水與RAN酶抑制劑混合（按9:1比例配置）制成混合液，取10μl將病毒RAN溶解，取2μl用于RT-PCR反應(yīng)模板。②RT體系的組成建立：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液16μl，RAN酶抑制劑1μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，已溶解的病毒RNA2μl，總體積20μl。混勻放入PCR擴(kuò)增管，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下循環(huán)，42℃60min，98℃5min，擴(kuò)增完畢后備用。③PCR體系的組成建立：PCR反應(yīng)液16μl，TapDNA聚合酶2μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，總體積20μl?；靹?，并加入20μl礦物油覆蓋，放于PCR擴(kuò)增儀上，按如下擴(kuò)增程序擴(kuò)增94℃30S，55℃30s×35循環(huán)，72℃30s，72℃5min。擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測(cè)擴(kuò)增情況。

圖1　抗原PCR擴(kuò)增泳道1：陰性對(duì)照；泳道M：DNA分子maker；泳道2：陽(yáng)新對(duì)照；泳道3～5：待檢擴(kuò)增產(chǎn)物

3　結(jié)果

3.1不同類型豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病的抗體結(jié)果由表1可知，16個(gè)種豬場(chǎng)，共240份血清，陽(yáng)性數(shù)為220份，陽(yáng)性率為92%；32個(gè)商品代豬場(chǎng)共480份血清，陽(yáng)性數(shù)為350份，陽(yáng)性率為73%；54個(gè)散養(yǎng)戶共810份血清，陽(yáng)性數(shù)為587，陽(yáng)性率為72%。

表1　不同類型豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病的抗體陽(yáng)性率　　 （%）

表2　不同地區(qū)豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病的抗體陽(yáng)性率　　　 （%）

3.2不同地區(qū)豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病的抗體抗體檢測(cè)結(jié)果由表2可知，三個(gè)地區(qū)中桓仁縣豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽(yáng)性率最高，為80%，本溪，明山區(qū)分別為77%，72%。

3.3豬藍(lán)耳病的抗原由圖2可知，屠宰場(chǎng)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)生的陽(yáng)性率均為0。

圖2　豬藍(lán)耳病的抗原

4　討論

目前，豬繁殖與呼吸綜合征在養(yǎng)殖業(yè)已得到越來(lái)越多的重視?？贵w水平是反映豬群感染狀態(tài)或免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體水平的高低可以對(duì)于重大疫情的發(fā)生進(jìn)行科學(xué)預(yù)警預(yù)報(bào)，同時(shí)還能評(píng)估免疫接種效果，并為制定科學(xué)的免疫程序和獸藥的使用提供科學(xué)的依據(jù)，對(duì)于免疫工作也具有促進(jìn)作用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前檢測(cè)PRRSV抗體較為敏感的方法之一，ELISA檢測(cè)血清PRRS抗體敏感度高、特異性強(qiáng)，因此目前仍被許多國(guó)家和地區(qū)廣泛采用。本次檢測(cè)利用間接ELISA方法調(diào)查了2013年本溪地區(qū)種豬場(chǎng)、商品代豬場(chǎng)、散養(yǎng)戶的PRRS免疫豬場(chǎng)的抗體水平。由測(cè)定結(jié)果可知，種豬場(chǎng)的免疫抗體陽(yáng)性率最高，商品代和散養(yǎng)戶雖然都明顯低于種豬場(chǎng)，但都達(dá)到了70%以上，種豬場(chǎng)和商品代的陽(yáng)性率高于散養(yǎng)戶，原因是其對(duì)該病重視程度較高，能夠定期進(jìn)行免疫，飼養(yǎng)管理規(guī)范，定期消毒；散養(yǎng)戶的免疫合格率偏低，與飼養(yǎng)管理水平落后、養(yǎng)殖環(huán)境惡劣、引種混亂、免疫程序不科學(xué)及疫苗使用不規(guī)范等不良因素的存在有很大的關(guān)系。以往用于診斷PRRS的方法有病毒分離鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、ELISA和RTPCR等。對(duì)隱性感染或持續(xù)帶毒豬進(jìn)行檢測(cè)的方法必須具備高敏感性及高特異性。而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性低等缺點(diǎn)。曾建立了高致病性PRRSVRT-PCR鑒定技術(shù)，然而該方法的靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)比較有明顯的差距。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一將常規(guī)PCR與熒光檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，不僅具有敏感性高、特異性強(qiáng)、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，而且可以通過(guò)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果準(zhǔn)確直觀，十分有利于病原體的檢測(cè)。本調(diào)查采用熒光定量RT-PCR方法對(duì)采集的豬組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果為待檢樣品均為陰性，表明本地區(qū)發(fā)生豬藍(lán)耳病的危險(xiǎn)性較低。

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2015）04-0049-02

收稿日期：（2015-01-21）