李適云++何裕堅++張宏濤

摘 要：本文通過細(xì)致分析與探究微板吸光法用于測定環(huán)境毒物對藻生長的抑制效應(yīng)，指出微板吸光法是1種以微藻為指示生物，置于96孔板培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀連續(xù)測定其吸光度，從而評價毒物毒性的方法。大量試驗(yàn)成果可證實(shí)該法具有所需樣品量少、易于設(shè)置多濃度、節(jié)約時間、與標(biāo)準(zhǔn)錐形瓶法有良好一致性等優(yōu)點(diǎn)，是1種切實(shí)可行的檢測方法。因此，隨著社會的發(fā)展，環(huán)境樣品和有毒化學(xué)品檢測數(shù)目的極速增長，該法仍具有繼續(xù)擴(kuò)大基礎(chǔ)研究，強(qiáng)化實(shí)際應(yīng)用性能的意義。

關(guān)鍵詞：微板吸光法；毒性試驗(yàn)；生態(tài)毒理；藻類；酶標(biāo)儀

中圖分類號：X55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150733001

藻類是水體的初級生產(chǎn)者，對維持水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性起著十分重要的作用。此外，藻類繁殖快，個體小，對環(huán)境毒物敏感，容易在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)。因此，評價污水、農(nóng)藥等環(huán)境樣品的生態(tài)毒性時都把藻類生長抑制效應(yīng)作為標(biāo)準(zhǔn)毒性測試方法，如經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織OECD和中國國家環(huán)境保護(hù)總局[2]等。但標(biāo)準(zhǔn)測試法一般都用錐形瓶作為藻類培養(yǎng)的容器，進(jìn)行試驗(yàn)時，存在樣品體積大、工作量大、試驗(yàn)條件難以維持一致等缺點(diǎn)。隨著環(huán)境樣品檢測數(shù)目的增加，亟須找到一種高效便捷的測試方法。

1 微板吸光法的概述

細(xì)胞計數(shù)法、可見分光光度法、熒光分光光度法和葉綠素a含量測定法是目前測定微藻生長情況的基本方法 [2]。據(jù)報道，對不同培養(yǎng)時間、不同生理狀態(tài)的微藻進(jìn)行光譜掃描也能獲得一致的吸收峰，其測得的光密度值（OD值）與細(xì)胞計數(shù)密度值具有良好的線性擬合相關(guān)性，表明可見分光光度法可用來真實(shí)反映微藻在培養(yǎng)過程中的生長情況[3]?？梢姺止夤舛确☉{借其方便快捷、重復(fù)性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)而被廣泛使用。同時結(jié)合酶標(biāo)儀多孔自動化檢測性能，1種高效新型的測定方法應(yīng)運(yùn)而生——微板吸光法。微板吸光法已常用于微生物的毒性試驗(yàn)中，進(jìn)而讓微板吸光法作為藻類生長抑制試驗(yàn)的測試手段奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。

2 微板吸光法的特點(diǎn)

縱觀國內(nèi)外學(xué)者利用微板吸光法進(jìn)行的藻類毒性試驗(yàn)，可總結(jié)出以下特點(diǎn)：PAIX?O等[4]將微板法與錐形瓶法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其試驗(yàn)結(jié)果比較一致；孫禾琳等[5]用微板吸光法對多鐘持久性有機(jī)污染物（POPs）進(jìn)行毒性評價，證實(shí)微板吸光法所需樣品量少，成本降低，可以快速測定微藻的毒性；SATOH等[6]也用該法測試了Cu，As，Sb，Pb和Cd對9種微藻的毒性，表明該種方法對多種藻類都適用，且方便設(shè)置多個平行和多個濃度；Geis等證明微板試驗(yàn)操作簡單，節(jié)省時間，降低平行測定的變異，顯著提高空白試驗(yàn)的重復(fù)性。

3 微板吸光法應(yīng)用于藻類毒性試驗(yàn)

3.1 測定藻類生長抑制效應(yīng)

先摸索藻類在微板吸光法中的最佳波長、pH、暴露時間等條件，將藻種進(jìn)行活化和多次預(yù)培養(yǎng)，使其在合適的條件下長至對數(shù)生長期，試驗(yàn)前1～2d轉(zhuǎn)接藻種至新鮮培養(yǎng)基，待其OD值為0.10左右備用。為了防止邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生，在96孔板的四周36個孔中加入250μL去離子水[7]；空白對照組的孔加入100μL去離子水和150μL藻液；試驗(yàn)組的孔加入100μL受試物試驗(yàn)液和150μL藻液。向微板加透明蓋后置于適宜的條件下培養(yǎng)，在試驗(yàn)的0h、24h、48h、72h振蕩微板5s，將其放入酶標(biāo)儀中，測定微藻的OD值。對濃度-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，即可算出半數(shù)抑制濃度EC50及95%置信區(qū)間[8]。

3.2 用于農(nóng)藥高通量篩選的研究

新農(nóng)藥的研發(fā)需要合成篩選上萬個化合物，以常規(guī)的溫室盆栽法和培養(yǎng)皿法作為初篩法，是很難在短時間內(nèi)完成的。微板吸光篩選法不僅能縮小測試規(guī)模，而且農(nóng)藥用量少、篩選速度也快。對于一些只能得到微克級的農(nóng)藥，微板吸光法更簡單易行。嚴(yán)航貞等[9]提出用該法測定除草劑活性，并與標(biāo)準(zhǔn)錐形瓶法的結(jié)果作比較，得出二者結(jié)果相符，證實(shí)微板吸光法可作為農(nóng)藥高通量篩選的1個備選方法。

4 目前還存在的問題

由于微板孔體積很小，需要考慮測試載體、光照均勻性、蒸發(fā)量等條件對藻毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響，但關(guān)于上述影響因素的系統(tǒng)研究卻很少；個別微板吸光法的結(jié)果擬合系數(shù)較低，需提高試驗(yàn)的重復(fù)性，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)方法；微板的材質(zhì)、試驗(yàn)中振蕩頻率不足，會導(dǎo)致藻類容易沉降或黏附在微板壁上，測得OD值偏低；微板孔中添加藻液和受試物的量都較少，易產(chǎn)生誤差，因此在試驗(yàn)中要盡量設(shè)置多個平行及濃度；對于一些顏色較深的試驗(yàn)樣品，有可能會導(dǎo)致 OD值偏高 [10]，進(jìn)而影響微板吸光法的準(zhǔn)確性。

5 結(jié) 語

雖然，目前有實(shí)際的應(yīng)用問題仍需解決，微板吸光法測定藻毒性的試驗(yàn)條件還不夠成熟，但該法在投入更少成本、時間、用量的情況下，卻能處理更多樣品、便于多濃度多平行測試，適合測試量少的環(huán)境樣品、新型化合物和昂貴化學(xué)品。這使得擴(kuò)大微板法測試范圍的基礎(chǔ)研究，強(qiáng)化微板吸光法的實(shí)際應(yīng)用性能已勢在必行。

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作者簡介：李適云（1987-），女，廣東佛山人，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生，從事研究生態(tài)毒理方面的工作。