陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 楊清建， 賈傳龍， 盧勇舟， 周軼群, 楊 平， 郭 妤， 朱晶晶， 劉天一

作者單位：200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科

羅格列酮調(diào)控光老化成纖維細(xì)胞周期阻滯的研究

陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 楊清建， 賈傳龍， 盧勇舟， 周軼群, 楊 平， 郭 妤， 朱晶晶， 劉天一

目的 探討羅格列酮對(duì)光老化成纖維細(xì)胞的周期及相關(guān)蛋白的影響。方法 采用cck-8法檢測(cè)羅格列酮對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響。羅格列酮預(yù)處理成纖維細(xì)胞48 h，采用UVB 120 mJ/cm2反復(fù)照射4次，照射間隔時(shí)間12 h，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞光老化模型，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞周期，Western Blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白p53和p21。結(jié)果 低劑量羅格列酮對(duì)成纖維細(xì)胞的活性無(wú)影響。40 μM羅格列酮預(yù)處理的光老化成纖維細(xì)胞與單純UVB照射組相比，S期的比例下降了15.9%。與對(duì)照組相比，40 μM羅格列酮預(yù)處理組中成纖維細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)分別下降了35.7%和27.7%。 結(jié)論 羅格列酮可降低光老化成纖維細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)，緩解UVB引起的光老化成纖維細(xì)胞的S期阻滯，可能對(duì)光老化成纖維細(xì)胞具有某種保護(hù)作用。

羅格列酮; 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ; 光老化; 成纖維細(xì)胞; 細(xì)胞周期

與其他器官不同，皮膚在受到內(nèi)源性老化調(diào)控的同時(shí)，也受到外界環(huán)境因素和生活方式的影響。紫外線(xiàn)輻射作為主要的外源性促衰老因素，可引起暴露處皮膚的外源性老化，又稱(chēng)為光老化[1]。成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs) 是皮膚的主要組成細(xì)胞成分，在分泌、維持皮膚細(xì)胞外基質(zhì)平衡，保持細(xì)胞彈性等方面具有重要作用，其在光老化進(jìn)程中的作用也日益受到重視[2-3]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在UVB引起的光老化FBs中，出現(xiàn)明顯的S期阻滯，使細(xì)胞復(fù)制生長(zhǎng)受限，進(jìn)而影響功能發(fā)揮[4]。最近許多研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)作為細(xì)胞核激素受體家族中的配體激活受體成員，在體內(nèi)外的細(xì)胞衰老進(jìn)程中起調(diào)節(jié)作用[5-6]。為了了解PPAR-γ對(duì)光老化FBs細(xì)胞的生物學(xué)作用，自2014年3～7月，我們使用羅格列酮(rosiglitazone, RO)作為PPAR-γ的激動(dòng)劑，研究其對(duì)光老化FBs細(xì)胞S期阻滯及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并對(duì)產(chǎn)生的結(jié)果作出相應(yīng)分析。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚細(xì)胞的獲取 取新生SPF級(jí)C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉處死，浸泡于75%乙醇中10 min，用DMEM洗去殘留乙醇，置于培養(yǎng)皿中，分離背部皮膚，取皮膚組織塊約1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37 ℃恒溫消化4 h；將皮膚取出，分離表皮和真皮，將真皮剪碎后，置于0.1%膠原酶中，37 ℃恒溫?fù)u床消化2 h，至組織塊基本消失。1500 r/min離心5 min，收集沉淀；棄上清，用DMEM+10%FBS制成細(xì)胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接近80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，比例約為1∶4。

1.2 藥物處理及光老化模型的建立 選用P2代細(xì)胞，首先探索應(yīng)用含不同RO濃度DMEM +10% FBS處理48 h。cck-8檢測(cè)細(xì)胞活性，選取合適濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分成4組：正常組(無(wú)RO預(yù)處理， 無(wú)UVB照射)，RO組(RO預(yù)處理，無(wú)UVB照射)，UVB組(無(wú)RO預(yù)處理，UVB照射)，UVB+RO組(RO預(yù)處理，UVB照射)。然后采用此前本研究小組確立的方法[4]，移去培養(yǎng)液，覆蓋薄層PBS緩沖液，置于UVB燈管(Philips TL 20 W/01RS lamp)正下方，打開(kāi)蓋子，進(jìn)行照射，照射劑量(使用Lutron UV light meter測(cè)量)為120 mJ/cm2。照射完畢后，吸去PBS，加入10 ml DMEM+1% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h照射1次，120 s/次，共4次；末次照射完成后改成DMEM+10%FBS培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 正常細(xì)胞或光老化細(xì)胞末次照射48 h后，移去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌1次，胰酶消化細(xì)胞，離心去上清，PBS洗2次,-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇重懸，4 ℃保存過(guò)夜后，PBS洗2次，重懸于0.5 ml PBS中。加入50 μg/ml的碘化丙啶和1 mg/ml的RNA酶，避光室溫30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。各細(xì)胞周期分布使用ModiFit LT v2.0軟件分析。

1.4 周期相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 正常細(xì)胞或光老化模型(stress-induced premature senescence, SIPS)細(xì)胞末次照射48 h后，移去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌3次，加入蛋白裂解液500 μl，用1 ml針頭反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，冰上靜置15 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取各個(gè)處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度，和等體積2×上樣緩沖液混合，煮沸并離心，電泳分離蛋白并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀釋的p53、p21( abcam 1∶500) 和 GAPDH(boster 1∶2000)，4 ℃孵育過(guò)夜。采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶2000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 RO對(duì)小鼠FBs活力的影響 為選擇適合的RO濃度處理細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)，我們分別使用梯度RO濃度的DMEM +10%FBS處理小鼠FBs，發(fā)現(xiàn)較低濃度的(0～40 μM)RO對(duì)FBs的活性無(wú)影響，而較高濃度(80 μM)的RO會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性(圖 1)，對(duì)細(xì)胞的正常增殖產(chǎn)生不利影響。因此，我們選擇40 μM的RO作為后續(xù)細(xì)胞處理的藥物濃度。

2.2 RO可緩解光老化FBs的S期阻滯 為了檢測(cè)RO對(duì)光老化FBs周期的影響，以120 mJ/cm2UVB照射4次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，流式檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示UVB模型組與正常組相比，細(xì)胞發(fā)生明顯S期阻滯，S期細(xì)胞比率為正常組的5.2倍。加入40 μM RO預(yù)處理可明顯抑制S期阻滯的發(fā)生，細(xì)胞周期流式檢測(cè)顯示，UVB+RO組的S期細(xì)胞數(shù)為正常組的3.1倍，與UVB模型組相比卻下降15.9%，表明RO處理可明顯緩解光老化FBs的S期阻滯，而單純RO處理并不會(huì)對(duì)FBs細(xì)胞周期產(chǎn)生影響(圖2)。

2.3 RO可降低光老化FBs的周期相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá) 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53、p21作為細(xì)胞衰老的常用指標(biāo)[4]，會(huì)隨著細(xì)胞的老化而表達(dá)增加。用UVB以120 mJ/cm2共照射4次后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，從蛋白水平檢測(cè)p53和p21的變化。Western Blot結(jié)果顯示，與正常組相比，UVB模型組中細(xì)胞p53和p21的表達(dá)量分別增加2.8倍和2.7倍，UVB+RO組細(xì)胞p53與p21的蛋白表達(dá)亦升高，分別為2.0倍和1.7倍，但升高程度不如UVB模型組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明RO的預(yù)處理可明顯降低光老化FBs的p53與p21的表達(dá)。而單純RO處理的RO組細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

3 討論

紫外線(xiàn)輻射會(huì)損害人體暴露處的皮膚，影響皮膚顏色和彈性并導(dǎo)致光老化，表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、松弛、深而粗的皺紋、局部色素沉著或毛細(xì)血管擴(kuò)張，甚至可能出現(xiàn)各種良性或惡性腫瘤[1,7]。FBs作為真皮中的主體細(xì)胞成分，不僅能合成膠原纖維、彈性纖維等基質(zhì)成分，還分泌細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)重塑[8]，起到了維持ECM平衡和調(diào)節(jié)局部微環(huán)境的功能[9]。許多報(bào)道指出，外源性促衰老因素UVB可通過(guò)誘發(fā) DNA 鏈內(nèi)交聯(lián)形成嘧啶二聚體而直接損傷 DNA 雙鏈，亦可通過(guò)氧自由基間接影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞造成損害，從而誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯、凋亡，甚至壞死等[10-11]。我們的前期研究使用低細(xì)胞毒性劑量UVB成功建立體外FBs SIPS[4]，發(fā)現(xiàn)光老化的FBs細(xì)胞周期發(fā)生改變，出現(xiàn)明顯的S期阻滯現(xiàn)象，使細(xì)胞復(fù)制生長(zhǎng)受限，影響其功能的發(fā)揮。

圖1 不同濃度的羅格列酮處理小鼠成纖維細(xì)胞48 h后的細(xì)胞活性 a.0 b.10 μM c.20 μM d.40 μM e.80 μM f.cck-8檢測(cè)結(jié)果 圖2 流式檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞周期 a.正常組 b.RO組 c.UVB組 d.UVB+RO組 e.各組細(xì)胞S期數(shù)據(jù) 圖3 Western Blot檢測(cè)羅格列酮對(duì)UVB誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 a.p53的表達(dá) b.p21的表達(dá)

Fig 1 Cell activity of fibroblasts treated with different concentrations of RO at 48 h. a.0. b. 10 μM. c. 20 μM. d. 40 μM.e. 80 μM. f. the result of cck-8 test. Fig 2 Cell cycle of fibroblasts detected by flow cytometry. a. normal group. b. RO group.c. UVB group. d. UVB+RO group. e. data of S phase of cell cycle in each group. Fig 3 Effect of RO on UVB-induced alteration of cell cycle regulatory proteins in MDFs tested by Western Blot. a. the expression of p53. b. the expression of p21.

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)作為核激素受體家族中的配體激活受體，參與許多細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程的調(diào)控，目前已發(fā)現(xiàn)PPAR-α，PPAR-γ和 PPAR-δ[12]3種亞型。其中，PPAR-γ在脂肪組織中表達(dá)較高，可激活組織細(xì)胞中一系列基因的表達(dá)，增加葡萄糖氧化，增加葡萄糖和脂質(zhì)吸收，減少游離脂肪酸濃度和降低胰島素抵抗等功能[13]。針對(duì)此生物學(xué)功能，臨床上已經(jīng)選擇具有強(qiáng)烈PPAR-γ激動(dòng)活性的化合物噻唑烷二酮類(lèi)(thiazolidinediones, TZDs)藥物，成功應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療。PPAR-γ除了具有上述功能之外，還可通過(guò)改善氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)慢性炎癥反應(yīng)等參與生物體內(nèi)老化[6]，以及體外細(xì)胞的老化過(guò)程[5,14]。近年來(lái)，對(duì)PPAR-γ在皮膚疾病和老化中具體生物學(xué)作用的研究越來(lái)越多，Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，一種山柰屬植物中的提取物5,7-DMF可激活PPARα/γ，有抗炎作用并能減少UVB輻射后人皮膚成纖維細(xì)胞中MMPs的表達(dá)。Flori等[16]實(shí)驗(yàn)證明，一種共軛多烯醛結(jié)構(gòu)的脂溶性色素衍生物Octa能通過(guò)激活PPAR-γ來(lái)促進(jìn)皮膚中黑素的合成，緩解皮膚的日光曬傷。Mastrofrancesco等[17]研究發(fā)現(xiàn)，壬二酸可以緩解UV引起的人皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，起到細(xì)胞保護(hù)作用，這可能也與PPAR-γ的激活有關(guān)。這些都表明了RRAR-γ在光老化中存在保護(hù)作用的可能性，為此，本研究探討利用PPAR-γ的特異性強(qiáng)效激動(dòng)劑RO作為影響因素，觀(guān)察其對(duì)光老化的FBs的生物學(xué)作用，尤其是要了解對(duì)于UVB誘導(dǎo)所致的FBs中S期阻滯的影響。

在細(xì)胞周期中，S期是周期循環(huán)的中心環(huán)節(jié)，主要進(jìn)行細(xì)胞DNA的解旋和復(fù)制，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，120 Jm/cm2的4次UVB照射使小鼠FBs發(fā)生顯著的S期阻滯現(xiàn)象[4]，大量細(xì)胞堆積于S期，使發(fā)生DNA復(fù)制、重排、堿基配對(duì)錯(cuò)誤等概率增加，這既影響細(xì)胞正常增殖能力，又容易引起基因表型改變，最終影響FBs在皮膚中正常功能的發(fā)揮。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,40 μM RO可明顯緩解UVB誘導(dǎo)光老化FBs出現(xiàn)的S期阻滯現(xiàn)象，至少使我們更加確認(rèn)UVB誘導(dǎo)的體外FBs模型的主要靶點(diǎn)之一是S期阻滯，也提示我們針對(duì)S期阻滯的干預(yù)措施可能是有效逆轉(zhuǎn)或者緩解細(xì)胞老化的措施。

細(xì)胞周期阻滯，受到諸多調(diào)控因子以及包括p53、p21和p16在內(nèi)的多種抑癌基因復(fù)雜而精確的控制，而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的因素又激活細(xì)胞衰老信號(hào)通路，造成細(xì)胞衰老或凋亡。p19/p53/p21通路作為經(jīng)典的衰老信號(hào)通路之一[18]，在細(xì)胞的老化和凋亡中起著重要作用?；罨膒53蛋白能與DNA接合，促使包括p21蛋白編碼基因WAF1/CIP1在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期阻滯甚至凋亡[19]，使衰老細(xì)胞增殖能力下降[20-21]。本研究中，光老化FBs發(fā)生了S期阻滯，衰老通路蛋白p53和p21表達(dá)顯著升高也符合細(xì)胞衰老的生物學(xué)特征[9]，進(jìn)一步驗(yàn)證了UVB對(duì)SIPS的成功誘導(dǎo)。Western Blot檢測(cè)顯示,40 μM RO可明顯降低UVB誘導(dǎo)光老化FBs中p53和p21的高表達(dá)，但究竟這兩種蛋白成分只是細(xì)胞衰老的結(jié)果，還是一些作用因子尚需深入研究。

總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)，RO可下調(diào)UVB引起的周期相關(guān)蛋白p53和p21的高表達(dá)，改善光老化FBs的S阻滯，為了解皮膚光老化的途徑和機(jī)制提供了一個(gè)指標(biāo)和現(xiàn)象，有可能為臨床治療提出了一種手段。但RO調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白p53和p21的具體機(jī)制及其對(duì)光老化細(xì)胞其他方面的影響仍需進(jìn)一步地研究。

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Regulation of rosiglitazone in the cell cycle arrest of photoaging fibroblasts

CHENLiang,BIBo,ZENGJi-ping,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,theEastChinaHospitalofFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To investigate the influence of rosiglitazone in cell cycle and associated proteins. Methods The influence of rosiglitazone on fibroblasts proliferation was measured by cck-8 assay. After rosiglitazone pretreatment for 48 h, fibroblasts were irradiated by a series of 4 UVB exposures at the dose of 120 mJ/cm2with an interval time of 12 h. The influence of rosiglitazone on fibroblasts cycle was analyzed by flow cytometry and the expressions of cell cycle regulatory proteins p53 and p21 were evaluated by Western Blot 48 h after the last exposure. Results No modification in the proliferative activity of MDFs was observed at any dose tested up to 80 μM after 48 h (P<0.01). The cell cycle arrest in S phase of fibroblasts pretreated with rosiglitazone was 15.9 % less than the UVB group. The expressions of cell cycle regulatory proteins p53 and p21 were decreased by 35.7% and 27.7% respectively compared with UVB group. Conclusion Rosiglitazone could decreased the expressions of p53 and p21, cell cycle regulatory proteins of photoaging fibroblasts, relieve the cell cycle arrest of photoaging fibroblasts caused by UVB, so its application may have some protective effect on photoaging fibroblasts.

Rosiglitazone; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Photoaging; Fibroblasts; Cell cycle

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272125；81301642)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(XBR2011033)；863項(xiàng)目資助項(xiàng)目(SS2014AA020705)

作者單位：200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科

陳 亮(1988-)，男，山東淄博人，碩士研究生.

劉天一，200040，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.07.019

R977

A

1673-7040(2015)07-0436-05

2015-04-10)