程方圓 王小娥 鐘殿勝 孫琳琳 王倩 劉暢

原發(fā)性支氣管肺癌（primary bronchogenic carcinoma,PBC），簡稱肺癌，不論是發(fā)病率還是死亡率均居全球癌癥首位，積極提高肺癌的診治水平具有十分重要的意義。臨床工作中影像學(xué)、病理學(xué)是肺癌診斷的重要依據(jù)，血清中的腫瘤標(biāo)記物檢測已成為肺癌診斷的重要參考指標(biāo)。目前常用的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白片段19、神經(jīng)原特異性烯醇化酶等[1]，敏感性或特異性尚不能滿足臨床工作需要，因此，積極探索尋找更有意義的腫瘤標(biāo)記物是現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究的重要課題之一。

碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX）為跨膜蛋白，屬于碳酸酐酶家族中一員。CAIX在人體正常組織中低表達(dá)，但在肺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，且在腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CAIX的細(xì)胞膜外部分可被蛋白酶水解，形成可溶性碳酸酐酶IX（soluble form of CAIX, s-CAIX），在血液中可以檢測到，可用于腫瘤的診斷和治療后評估。目前關(guān)于肺癌血清中CAIX的研究報(bào)道極少，本研究旨在探索血清CAIX對肺癌的診斷價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組 選自2012年6月-2013年3月在我院呼吸科、腫瘤科及肺外科住院治療確診為肺癌的47例患者，包括男性26例，女性21例。根據(jù)患者病理類型不同進(jìn)行分類，包括鱗癌（n=7）、腺癌（n=26）、小細(xì)胞癌（n=10）及病理類型未明確（n=4）；按照肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，包括I期+II期患者6例，III期+IV期患者41例。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①氣管鏡活檢組織和組織刷片、開胸肺活檢組織、胸水液基及沉淀物經(jīng)病理檢查見腫瘤細(xì)胞，結(jié)合免疫組化染色及影像學(xué)檢查最終診斷為肺癌；②入組前未接受放療、化療等任何抗腫瘤治療。

1.1.2 對照組 選自2012年7月-2012年12月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院體檢中心體檢的31例患者，包括男性18例，女性13例。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：查體、化驗(yàn)及影像學(xué)等檢查結(jié)果均無異常的健康體檢者。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和處理 所有研究對象于肘靜脈抽取約3 mL靜脈血，置于紅蓋非抗凝普通管，在4 ℃條件下以3,000 r/min離心10 min，取出上清置于-40 ℃冰箱儲(chǔ)存。于實(shí)驗(yàn)室檢測前常溫下一次性解凍所有標(biāo)本。

1.2.2 主要試劑 CAIX測定試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2.3 檢測方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法檢測患者血清中CAIX含量，具體操作嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，對實(shí)驗(yàn)組和對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，因不符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用多組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制CAIX診斷肺癌的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC曲線）并計(jì)算曲線下面積（area under the curve, AUC）及曲線各坐標(biāo)的敏感度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組及對照組患者血清中CAIX含量 實(shí)驗(yàn)組47例[男性26例，女性21例，年齡（65±11）歲]和對照組31例[男性18例，女性13例，年齡（61±10）歲]，兩組間年齡差異（t=1.572,P＞0.05）及性別差異（χ2=0.57,P＞0.05）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別對兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組結(jié)果均不符合正態(tài)分布（P＜0.05），故計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距Md（Q）表示，兩組間采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組患者血清中CAIX含量為290.12（215.53-550.24）pg/mL，對照組血清中CAIX含量為56.54（41.83-94.18）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組較對照組血清CAIX含量明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.876,P＜0.001）（圖1）。

2.2 實(shí)驗(yàn)組中不同病理類型肺癌患者血清中CAIX含量比較 實(shí)驗(yàn)組47例患者根據(jù)病理類型不同分為鱗癌組（n=7）、腺癌組（n=26）、小細(xì)胞癌組（n=10），其余4例患者因病理類型不明確不參與統(tǒng)計(jì)分析。

分別對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，提示三組均不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位間距表示Md（Q），結(jié)果顯示鱗癌組、腺癌組、小細(xì)胞肺癌組患者血清中CAIX含量分別為550.24（271.72-1,142.93）pg/mL、257.39（202.39-404.32）pg/mL、529.36（241.49-933.34）pg/mL。采用多組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)分析三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示三組患者血清中CAIX含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.122,P=0.017）。進(jìn)一步用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，分別對三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示：鱗癌組和小細(xì)胞癌組血清CAIX含量均高于腺癌組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），鱗癌組與小細(xì)胞癌組血清CAIX含量比較未發(fā)現(xiàn)兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 血清實(shí)驗(yàn)組I期+II期與III期+IV期肺癌患者血清中CAIX含量 根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Can-cer Control, UICC）2009年制定的第7版國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將47例肺癌患者分為I期+II期組（n=6）和III期+IV期組（n=41）。

兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示I期+II期肺癌患者血清中CAIX含量為330.10（250.97-754.65）pg/mL，III期+IV期肺癌患者血清中CAIX含量為290.12（205.17-525.82）pg/mL，比較兩者血清中CAIX含量，未發(fā)現(xiàn)兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.781,P=0.444）。

2.4 繪制血清CAIX診斷肺癌的ROC曲線 以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制血清CAIX診斷肺癌的ROC曲線，計(jì)算曲線下面積及各閾值的敏感度、特異度。血清CAIX的曲線下面積為0.961，血清中CAIX對于診斷肺癌有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。面積的95%CI: 0.914-1.008，不包括0.5，得出上述相同結(jié)論。當(dāng)血清中CAIX閾值為115.115 pg/mL時(shí)，敏感度和特異度分別為95.7%和90.3%（圖2）。

3 討論

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對照組患者血清中CAIX含量比較（pg/mL）。圖中實(shí)驗(yàn)組4和19號(hào)標(biāo)本CAIX含量超過1.5倍四分位數(shù)間距的值，為異常值，用“●”標(biāo)出。實(shí)驗(yàn)組12號(hào)和對照組63號(hào)標(biāo)本CAIX含量超出3倍四分位數(shù)間距的值，為極端值，用“*”標(biāo)出。Fig1 Comparison of the serum CAIX level in the experimental group with the control group (pg/mL). The serum CAIX level of number 4 and number 19 in the treatment group was more than 1.5 times higher than the quartile range value, and was considered as the abnormal value and marked with “●”. The serum CAIX level of number 12 in the treatment group and number 63 in the control group was more than 3 times higher than the quartile range value,and was considered as the extreme value and marked with “*”. CAIX: carbonic anhydrase IX.

圖2 血清CAIX診斷肺癌的ROC曲線Fig2 The ROC curve of serum CAIX in the diagnosis of lung cancer.ROC: receiver operating characteristic curve.

表1 不同病理類型肺癌患者血清CAIX含量比較（pg/mL）Tab1 Comparison of the serum CAIX level among different pathological types (pg/mL)

CAIX是一種含鋅金屬蛋白酶，屬于碳酸酐酶家族中一員，是一種新型的腫瘤抗原[2]。其相對分子質(zhì)量為58 kDa或54 kDa[3,4]，分為N末端信號(hào)肽、細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及細(xì)胞內(nèi)C末端4個(gè)不同部分[5]。在低氧[6]、抑癌基因VLH（von Hippel-Lindau）突變或甲基化[7,8]、細(xì)胞高密度[9]、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）活化[10]等情況下可誘導(dǎo)CAIX表達(dá)增高。CAIX的生理作用是通過催化H+和的可逆反應(yīng)生成H2O和CO2，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外酸堿度[11]。在活體腫瘤細(xì)胞內(nèi)CAIX可促進(jìn)H+與轉(zhuǎn)化為H2O和CO2，從而維持細(xì)胞內(nèi)弱堿性環(huán)境，利于細(xì)胞的生長繁殖[12]。同時(shí)CAIX將腫瘤細(xì)胞外CO2與H2O轉(zhuǎn)換為H+和被細(xì)胞膜上的泵泵入細(xì)胞內(nèi)，而H+可降低細(xì)胞外PH值，酸性環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞對放化療的抵抗[13]。因此，CAIX對腫瘤細(xì)胞生存及發(fā)展起重要調(diào)節(jié)作用。CAIX還可通過B-連環(huán)蛋白相互作用減少鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附，利于腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移[14]。

CAIX在胃粘膜細(xì)胞、膽囊的上皮細(xì)胞、胰腺胰管、小腸的隱窩細(xì)胞等少量正常組織中低表達(dá)[15]，但在多種惡性腫瘤組織中廣泛表達(dá)，如在肺癌[16,17]、腎癌[18]、宮頸癌[19]、外陰癌[20]、乳腺癌[21]等。Ivanov等[6]在87種惡性細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)其中50種可檢測到CAIX mRNA，因此，CAIX可被視為廣泛表達(dá)的腫瘤特異性標(biāo)記物。

研究[22,23]發(fā)現(xiàn)，支氣管和肺泡中均無CAIX表達(dá)。通過對175例手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，Swinson等[8,9]發(fā)現(xiàn)CAIX表達(dá)陽性率達(dá)81.8%。Kim等[24]對75例手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)CAIX在72%標(biāo)本中表達(dá)，Ilie等[16]在一項(xiàng)較大研究中發(fā)現(xiàn)在24.3%（135/555）NSCLC的腫瘤組織中存在CAIX高表達(dá)。多項(xiàng)研究[8,22,24,25]表明，NSCLC組織中CAIX的高表達(dá)與病理類型明顯相關(guān)，鱗癌CAIX表達(dá)陽性率較腺癌高。Kon-No等[26]研究顯示，CAIX表達(dá)陽性的患者無病生存期（disease-free survival, DFS）和總生存期（overall survival, OS）明顯短于CAIX表達(dá)陰性的患者。

Zavada等[3]證實(shí)，CAIX細(xì)胞外的部分可被蛋白酶水解，生成s-CAIX，并釋放到患者的血液、尿液中。Ilie等[16]運(yùn)用ELISA法對209例術(shù)后經(jīng)病理診斷明確的NSCLC患者血清中CAIX含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，NSCLC血清中CAIX含量均值為45.40（0-372.89）pg/mL明顯高于健康對照組均值2.48（0-16.65）pg/mL，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，肺癌患者血清CAIX含量為290.12（215.53-550.24）pg/mL，正常對照組血清中CAIX含量為56.54（41.83-94.18）pg/mL，肺癌組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Ilie等[16]結(jié)論一致。但本研究檢測值明顯高于文獻(xiàn)中的檢測值，考慮差異的產(chǎn)生與研究對象不同、種族差異、實(shí)驗(yàn)方法、使用的試劑盒及其靈敏度不同等有關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道肺鱗癌組織中CAIX陽性率高于腺癌，CAIX的表達(dá)與腫瘤組織壞死相關(guān)，而鱗癌較腺癌更易出現(xiàn)壞死。本研究也顯示，肺鱗癌組血清CAIX含量高于腺癌組。目前尚未檢索到小細(xì)胞癌患者血清CAIX含量的報(bào)道，本研究結(jié)果表明，小細(xì)胞肺癌患者血清CAIX含量較腺癌患者明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與鱗癌無差異。此外，血清CAIX診斷肺癌的ROC曲線研究顯示，曲線下面積為0.961，提示血清中CAIX含量檢測對于肺癌具有較高診斷價(jià)值。且當(dāng)血清中CAIX閾值為115.115 pg/mL時(shí)敏感度和特異度較高，分別為95.7%和90.3%。

綜上所述，血清中CAIX含量對于肺癌的診斷及病理類型的鑒別等具有一定的價(jià)值，在未來的臨床工作中具有應(yīng)用前景。