林宮玄

顯微鏡的 納米時代

在17世紀(jì)光學(xué)顯微鏡發(fā)明后，微米（1微米=10-6米）大小的細(xì)胞映在人類眼前，開啟了微生物學(xué)。1873年，恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）證明了光學(xué)顯微鏡的分辨率只能達(dá)到光波長的1/2左右，稱為阿貝極限。而人類所能看到的光波長在400納米（1納米=10-9米）到700納米左右，因此200納米或0.2微米一直是一般光學(xué)顯微鏡分辨率無法突破的瓶頸。

在光學(xué)顯微鏡發(fā)明后的幾百年間，微米左右的物體一直是人類所能觀察到的最小尺度。直到20世紀(jì)初電子顯微鏡的問世，人類才開始看到納米大小的物體。但是“顯納鏡”這個詞并沒有被廣泛使用?，F(xiàn)今，顯微鏡已不代表是只能看見微米尺度的儀器。顯微鏡的功用是將微小物體的影像放大，使肉眼能夠看見。不過生活用語中的顯微鏡，仍大多指光學(xué)顯微鏡。

既然電子顯微鏡的分辨率能看到納米物體，為什么一般光學(xué)顯微鏡仍是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的研究工具呢？主要原因在于電子顯微鏡只能觀察經(jīng)過冷凍切片處理的生物樣品。換言之，樣品是死的。原子力顯微鏡也是擁有納米分辨率的儀器，目前已發(fā)展到可觀察水中的活細(xì)胞。然而原子力顯微鏡只能觀察到樣品表面的形貌，無法看到細(xì)胞內(nèi)部的構(gòu)造。雖然一般光學(xué)顯微鏡的分辨率遠(yuǎn)比電子顯微鏡與原子力顯微鏡分辨率差，但是具有觀察活細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造隨時間變化的優(yōu)勢。因此，光學(xué)顯微鏡至今仍是研究生命科學(xué)很普遍的利器。2014年，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎頒給了美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的艾力克·貝吉格（Eric Betzig）、德國馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所的斯特凡·赫勒（Stefan Walter Hell），以及美國斯坦福大學(xué)的威廉·莫厄納（William Esco Moerner）三人，表揚(yáng)他們將光學(xué)顯微鏡帶到納米世界的貢獻(xiàn)。

TIPS

什么是納米？

納米又稱毫微米，是一種長度單位，1納米為1/100萬毫米，也就是1/10億米。 納米科技是本世紀(jì)重要的尖端科技之一，全世界先進(jìn)國家均投入大量經(jīng)費(fèi)在這跨物理、化學(xué)、生物、材料與工程等領(lǐng)域的項(xiàng)目上。

突破 阿貝極限

超解析熒光顯微鏡的發(fā)明使顯微技術(shù)出現(xiàn)了新的契機(jī)。所謂“超解析”的意思是突破阿貝極限，讓分辨率達(dá)到幾十納米，使科學(xué)家可以觀察活細(xì)胞內(nèi)納米物體的變化，譬如研究分子如何在腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞之間形成突觸。

阿貝極限雖證明了一般光學(xué)顯微鏡的分辨率，但科學(xué)家們?nèi)匀幌氡M各種辦法希望能夠突破阿貝極限，直接看到超高分辨率的光學(xué)影像。使用近場光學(xué)掃瞄顯微鏡便是其中一個直接的方法。其原理與原子力顯微鏡類似，利用光纖當(dāng)作針尖，以非?？拷郎y物表面至幾個納米的距離，掃描待測物的光信號。雖然近場光學(xué)顯微鏡可利用微小的針尖達(dá)到20納米的分辨率，但是針尖越小，收光效率越差，在生物影像應(yīng)用上沒有得到好的成效。

另一方面，如果對于照明光源的物理特性了如指掌，也可經(jīng)由數(shù)學(xué)分析，得到超解析光學(xué)影像。譬如，構(gòu)造化照明顯微術(shù)借由控制照明光的周期圖案與待測物的干涉形成云紋圖形，并將影像經(jīng)過計(jì)算后，其分辨率可突破阿貝極限。經(jīng)由數(shù)學(xué)方法，構(gòu)造化照明顯微術(shù)可以將一般光學(xué)影像的分辨率提高到兩倍以上。臺灣“中央研究院”應(yīng)用科學(xué)研究中心李超煌博士所發(fā)明的超解析光學(xué)顯微鏡，也是利用調(diào)控光源與待測物的交互作用，借由影像后處理得到小于200納米的分辨率。

TIPS

阿貝極限

19世紀(jì)末，德國物理學(xué)家恩斯特·阿貝指出：光學(xué)顯微鏡分辨率的極限，大約是可見光波長的一半?？梢姽庵胁ㄩL最短的是藍(lán)紫光，其波長在0.4微米左右。因此，如果兩點(diǎn)之間的距離小于0.2微米，我們將無法分辨出這是兩個點(diǎn)。這就是通常所說的“阿貝極限”。阿貝極限使我們無法更加深入地了解微觀世界，例如病毒的直徑通常就在0.02～0.3微米，無法用已有的光學(xué)顯微鏡觀察清楚。

神奇的 綠熒光蛋白質(zhì)

熒光分子在受到高能量（短波長）的光激發(fā)以后，會放出較低能量（長波長）的光，稱為熒光。熒光顯微鏡已經(jīng)是生命科學(xué)中很常見的研究工具。綠熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，使得細(xì)胞不必經(jīng)由額外熒光染色便可直接觀察，成為活細(xì)胞動態(tài)變化觀察的強(qiáng)力工具。因此，諾貝爾獎在2008年表彰綠熒光蛋白質(zhì)的合成技術(shù)，它讓熒光顯微鏡能用來觀察活細(xì)胞的形態(tài)變化。

1989年，莫厄納首度量測到單一分子對光的吸收，開啟了單一分子的研究領(lǐng)域，吸引許多科學(xué)家投入。1997年，莫厄納在單一綠熒光蛋白質(zhì)分子的突變體上有重要的發(fā)現(xiàn)，引發(fā)了許多利用光活化來控制綠熒光蛋白質(zhì)發(fā)光的研究，譬如2002年，美國國家衛(wèi)生院的利平科特·施瓦茨（Jennifer Lippincott-Schwartz）在美國《科學(xué)》（Science）期刊發(fā)表了一種綠熒光蛋白質(zhì)突變體：原本不會發(fā)光的綠熒光蛋白質(zhì)突變體，在413納米激光照射后會變成活化態(tài)，被488納米激光發(fā)可放出熒光（509納米）;而在持續(xù)以488納米光的激發(fā)下，分子最后會因?yàn)楣馔噬?yīng)，無法再被活化而放出熒光。

不斷提升的 影像分辨率

1995年，貝吉格提出了利用熒光分子提高分辨率的想法：如果將不同顏色的熒光分子均勻染色在樣品中，讓每個顏色的熒光分子間距都大于阿貝極限，則可利用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)將分子精準(zhǔn)定位。只要將每個顏色的定位影像組起來，即使不同顏色的熒光分子距離只有幾納米，還是能解析出來。不過，要把這個想法實(shí)現(xiàn)很困難。譬如要如何將不同顏色的熒光分子均勻染色？

多年后，貝吉格看到了2002年施瓦茨在《科學(xué)》期刊發(fā)表綠熒光蛋白質(zhì)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)結(jié)果，讓他有機(jī)會實(shí)現(xiàn)在1995年提出的想法。他發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)并不需要區(qū)分熒光顏色，還是可以利用不同時間活化綠熒光蛋白質(zhì)的方式，來組合超高解析影像。貝吉格把這個技術(shù)稱為光活化定位顯微術(shù)，就是將會發(fā)光的蛋白質(zhì)接在溶小體（細(xì)胞胞器）的膜上，利用此顯微術(shù)得到超解析度的溶小體熒光影像，并于2006年與施瓦茨合作，成功實(shí)現(xiàn)了這個想法。同年，美國哈佛大學(xué)的莊曉薇也參考了貝吉格1995年的構(gòu)想，實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用其他生物常用的熒光分子隨機(jī)發(fā)光特性，也可達(dá)到超分辨率，并命名為隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)。

過去的20年，赫勒也一直想著如何突破阿貝極限，而他是從熒光分子的“受激放射”性質(zhì)著手，想到了一個利用熒光的開關(guān)來提升影像分辨率的方法，于1994年發(fā)表了受激放射耗乏顯微術(shù)。2000年以后，赫勒開始實(shí)驗(yàn)證明這個想法是可行的。他結(jié)合激發(fā)激光與受激放射耗乏激光，聚焦在熒光分子染色的生物樣品上，借由納米精確度的掃描，可得到超解析熒光影像。

TIPS

自發(fā)性放射與受激放射

熒光分子有基態(tài)、激發(fā)態(tài)等形態(tài)。當(dāng)激發(fā)光源將電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)后，電子能量會在0.1納秒內(nèi)從高振動態(tài)遞減，并在最低振動態(tài)停留幾納秒。最后當(dāng)電子躍遷到基態(tài)中任何一個振動態(tài)而放出的光，即稱為自發(fā)性放射，一般熒光顯微鏡所觀察的光即是自發(fā)性放射的熒光。然而，若電子在激發(fā)態(tài)時，遇到另一道光剛好對應(yīng)在電子可躍遷的能量時，電子會受到刺激而馬上躍遷到基態(tài)并放出光，即受激放射。

向三維納米分辨率邁進(jìn)

超解析熒光顯微鏡提供了發(fā)明光學(xué)顯微鏡一個不同的思維。在沒有利用熒光分子的特殊性質(zhì)前，超解析光學(xué)顯微鏡是利用對光性質(zhì)的了解去設(shè)計(jì)的，與所要觀察的樣品無關(guān)。超解析熒光顯微鏡的原理所帶來的啟發(fā)，是可以針對觀察物的性質(zhì)，譬如熒光的開關(guān)控制行為來進(jìn)一步提升光學(xué)影像分辨率。臺灣有一部分研究就是受到這個概念所啟發(fā)，譬如臺灣“中央研究院”原子與分子科學(xué)研究所張煥正博士利用熒光納米鉆石發(fā)展受激放射耗乏顯微術(shù)，臺大物理學(xué)系朱士維教授利用金納米粒子的飽和作用，達(dá)成超解析光學(xué)影像;筆者就讀臺大光電工程學(xué)研究所時與指導(dǎo)教授孫啟光發(fā)表了利用脈沖激光在氮化銦鎵納米薄膜產(chǎn)生音波的非線性效應(yīng)，突破阿貝極限取得納米分辨率超音波影像。

結(jié)合人類原本就對光傳播性質(zhì)的了解，利用調(diào)控光源與待測物的交互作用，以及熒光分子的特殊性質(zhì)，讓超解析熒光顯微鏡的發(fā)展更快。譬如構(gòu)造化照明顯微鏡，可借由熒光分子的飽和效應(yīng)進(jìn)一步提升分辨率，稱為飽和構(gòu)造化照明顯微術(shù)。超解析熒光顯微鏡也搭配光源的分析，進(jìn)一步發(fā)展出三維納米分辨率的光活化定位顯微術(shù)、三維隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)、三維受激放射耗乏顯微術(shù)等。

雖然超解析熒光顯微鏡已經(jīng)證明可以直接觀察活細(xì)胞內(nèi)納米等級的蛋白質(zhì)與胞器，然而科學(xué)家是不會永遠(yuǎn)滿足于目前的分辨率。超解析熒光顯微鏡的分辨率有賴于好的熒光分子特性，譬如開關(guān)的控制或隨機(jī)性，及被激光打壞的功率上限;研制出好的熒光分子，以更方便地染在活細(xì)胞里，這是一條很清楚的路。

顯微鏡除了在分辨率上的追求，科學(xué)家也希望提升影像速度，方便觀察細(xì)胞內(nèi)快速的動態(tài)行為，目前這些技術(shù)最快也需要1秒左右取得一張高解析二維影像。為了解決影像速度的問題，近幾年來，光片照明顯微術(shù)開始蓬勃發(fā)展，今年從貝吉格實(shí)驗(yàn)室回國的陳壁彰博士也開始在臺灣“中央研究院”應(yīng)用科學(xué)中心研究光片照明顯微術(shù)。

隨著顯微技術(shù)的不斷提高和進(jìn)步，我們期待更好的光學(xué)顯微鏡讓科學(xué)家未來在生命科學(xué)領(lǐng)域有更多的突破和發(fā)現(xiàn)，幫助人類對抗疾病，改善人類的生活。