陳岳林 沈粵春

基礎研究

瘦素對大鼠血管張力的影響及機制研究

陳岳林 沈粵春

目的 探討瘦素對Wistar大鼠胸主動脈環(huán)血管張力改變及其影響因素。方法 15只雄性Wistar大鼠，按以下分組：①PBS對照組（C）；②0.1 mg/kg低濃度瘦素注射組（L）；③0.5 mg/kg高濃度瘦素注射組（H）。注射7 d。記錄大鼠日進食量、體重，測量平均動脈壓（MAP）；測定胸主動脈環(huán)對各種血管活性藥物的反應性；酶聯免疫吸附法測定血清中6-酮前列腺素F1α（6-Keto PGF1α）和血栓素B2（TXB2）水平。結果注射瘦素第 2天即明顯抑制大鼠進食量［H（21.75±2.41）g比 L（23.84±0.74）g比 C（28.54±1.15）g]。H 組大鼠體重在第 4 天開始顯著下降［H（259.25±9.31）g比 C（272.75±12.92）g，P＜0.05]，持續(xù)至第 7天［H（257.5±7.96）g比 C （281.25±11.28）g，P＜0.01]。與 C組比較，L組和 H 組 MAP無顯著升高［H（80.73±5.56）mm Hg比 L（83.45±7.47）mm Hg比 C（84.53±2.17）mm Hg，P＞0.05]。胸主動脈環(huán)對血管收縮劑（苯腎上腺素、花生四烯酸）的張力無顯著改變［10-3M 苯腎上腺素收縮百分比，H（133.64±26.06）%比L（146.98±20.34）%比C（140.91±22.17）%，P＞0.05；10-5M 花生四烯酸收縮百分比，H（22.52±1.55）%比 L（23.78±2.43）%比 C（22.76±1.1）%，P＞0.05]。但H組由一氧化氮（NO）介導的內皮細胞依賴性血管舒張劑乙酰膽堿（Ach）和緩激肽（BK）引起的舒張加強，Ach 半大效應濃度值減少（EC50）［H（-6.33±0.11）比 C（-5.69±0.12），P＜0.05]。瘦素加強 BK的舒張作用被內皮型一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME明顯抑制。H組體重變化與Ach最大舒張值百分比（Emax）呈正相關（r=0.737，P＜0.05）。另外，H 組血清 TXB2水平顯著升高［H（60.15±8.84）ng/ml比 C（50.44±6.4）ng/ml，P＜0.05]。結論 較長時間注射瘦素雖上調血小板收縮血管物質TXB2的表達，但綜合效應是增強動脈內皮細胞依賴的舒張功能，這與舒血管物質6-Keto PGF1α無關，而與增加內皮細胞NO表達及注射瘦素后攝食量減少、體重減輕、內皮細胞舒張功能改善有關。此研究結果為減肥防治高血壓提供了客觀依據。

瘦素； 內皮細胞； 環(huán)氧化酶-2； 前列環(huán)素； 血栓素； 血管張力

瘦素是一種由肥胖基因（ob基因）編碼的、167個氨基酸組成、相對分子質量約16 KDa的蛋白質產物，或稱為蛋白類激素，主要由脂肪細胞合成和分泌。瘦素進入血液循環(huán)后，作用于中樞和外周不同亞型的瘦素受體，主要功能是通過中樞系統(tǒng)抑制食欲、增加能量消耗以調節(jié)能量平衡[1]。瘦素還具有廣泛的生物學效應，如調節(jié)免疫、炎癥、造血等[1]。短時間（30 min）內使用超生理劑量（160 ng/ml）瘦素能增加內皮細胞表達內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）[2]，而使用生理劑量（10 ng/ml）瘦素能上調神經型一氧化氮合成酶（nNOS）的表達[3]。但較長時間（7 d）注射大劑量（1 μg·kg-1·min-1）瘦素卻能通過激活交感神經[4]、增加腎內氧化應激[5]等方式升高平均動脈壓（MAP）。目前關于較長時間注射瘦素的動物血管環(huán)對血管活性物質的反應性改變尚不明確,本研究將就此方面展開探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性Wistar大鼠15只（中山大學實驗動物中心）。

1.1.2 主要試劑 花生四烯酸（AA）（美國Sigma公司）；緩激肽（BK）（美國 Merck公司）；N-（2-甲氧基環(huán)己烷-4硝基）甲砜胺（NS-398）、N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（L-NAME）（上海碧云天）；6-Keto PGF1α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Cayman公司）；重組大鼠瘦素、TXB2Elisa試劑盒（美國 R&D公司）；Krebs-Henseleit（K-H）溶液（NaCl 118 mM，KCl 4.7 mM，CaCl22.5 mM，MgSO41.2 mM，KH2PO41.2 mM，NaHCO325 mM，Glucose 11 mM）（廣州化學試劑廠）。

1.1.3 主要器材 無創(chuàng)鼠尾血壓計（美國Kent公司）；JZ300型高精度張力換能器（量程5 g，北京新航興業(yè)科貿公司）；PowerLab數據采集分析系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將Wistar大鼠隨機分成3組：①PBS對照組（C組），注射生理鹽水；②0.1 mg/kg低濃度瘦素注射組（相當于瘦素缺乏型小鼠生理補充劑量，L組）；③0.5 mg/kg高濃度瘦素注射組（5倍生理補充劑量，H組）。分別向腹腔內注射等體積藥物7 d。SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，自由進食，晝夜時長為12 h∶12 h，記錄日進食量、體重及注射瘦素2 h后MAP。

1.2.2 大鼠離體胸主動脈環(huán)制備及張力測定 大鼠麻醉，胸主動脈分離，血管環(huán)制備及固定參考付陽等[6]方法。麻醉后從右心室抽取3 ml血液用于Elisa實驗。每只大鼠制備3條血管環(huán)，共15條/組。置37℃ K-H溶液中，平衡60 min，隔15 min更換K-H溶液，調整基礎張力值為2 g。用60 mM氯化鉀（KCl，預激液）預收縮平衡后，更換K-H溶液，并重復1次。分別測量10-3M苯腎上腺素（Phe，α受體激動劑）；10-5M AA（環(huán)氧合酶作用底物）及預先孵育3μM NS-398（選擇性COX-2抑制劑）[7]30 min后再加入AA各組的張力值。分別測量10-3M Phe預收縮穩(wěn)定后依次加入不同濃度（10-8～10-3M）乙酰膽堿（Ach，內皮細胞依賴的血管舒張劑）；（10-8～10-5M）BK（內皮細胞依賴的血管舒張劑）；（10-9～10-3M）硝普鈉（SNP，非內皮細胞依賴的血管舒張劑）及預先孵育0.3 mM內皮型一氧化氮合成酶抑制劑 L-NAME 30 min，再加入10-5M測各組的張力值。通過LabChart 7.2讀出張力數據，使用GraphPad Prism 5對曲線進行非線性擬合計算半大效應濃度值（concentration for 50%maximal effect，EC50）。

1.2.3 酶聯免疫吸附測定 采用ELISA（競爭法）測定各組血清中6-Keto PGF1α和TXB2水平。嚴格按照各自Elisa說明書進行：血清經離心、2倍稀釋、配制標準品、加樣、加酶標抗體、顯色、孵育及終止反應后，30 min內在酶標儀波長為405 nm處讀出各組6-Keto PGF1αOD值，在450 nm處讀出各組TXB2OD值。根據OD值及Elisa說明書公式計算出各標準品及待測樣品B/B0%。利用Curve Expert 1.3對曲線擬合后得出各自公式，根據公式計算待測樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。數據用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，進食量及張力值采用重復測量方差分析進行組間均值比較。當差異存在顯著性時，方差齊性用Bonferroni法，方差不齊用Dunnett′s T3進行兩兩比較。P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瘦素對進食量、體重及MAP的影響 注射瘦素第2天后大鼠進食量即開始減少，以H組最為明顯。兩瘦素注射組抑制大鼠進食量均在第4天達高峰，L組在5 d后不再顯著抑制進食量（P＞0.05），但H組持續(xù)至第7天（圖1）。在第4天及第7天觀察大鼠體重，與C組比較，注射瘦素后各組體重均有下降趨勢，L組變化不顯著，但H組體重顯著減輕（圖2）。隨注射時間的延長，各組MAP均有升高趨勢，但與C組比較，未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

圖1 注射瘦素對Wistar大鼠日進食量的影響

圖2 注射瘦素對Wistar大鼠第0、4、7天體重的影響

表1 注射不同濃度瘦素對Wistar大鼠平均動脈壓（MAP）的影響（±s）

表1 注射不同濃度瘦素對Wistar大鼠平均動脈壓（MAP）的影響（±s）

注：MAP：平均動脈壓

組別 例數 MAP（mm Hg）day（0） day（4） day（7）PBS 注射組 5 75.18±1.18 77.38±5.36 84.53±2.17 0.1 mg/kg leptin 注射組 5 74.88±1.88 77.35±4.78 83.45±7.47 0.5 mg/kg leptin 注射組 5 76.15±1.44 73.85±3.98 80.73±5.56

2.2 注射瘦素后胸主動脈環(huán)血管張力的改變 注射瘦素7 d后Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對10-3M Phe引起的收縮無顯著影響。以60 mM KCl收縮為100%作為對照，H 組［（133.64±26.06）%]比 L組［（146.98±20.34）%]比 C 組［（140.91±22.17）%]，P均＞0.05。瘦素對10-5M AA及預先孵育3μM NS-398 30 min后再加入10-5M AA引起的收縮也無顯著改變（圖3）。但H組由NO介導的內皮細胞依賴性血管舒張劑Ach和BK引起的舒張均加強（圖4、5），Ach EC50值減?。ū?2）。為了進一步說明高濃度瘦素加強由NO介導的內皮細胞依賴性舒張功能，研究通過預先孵育0.3 mM L-NAME 30 min后加入10-5M BK，瘦素加強BK的舒張效應消失（表2），由SNP引起的非內皮細胞依賴的舒張功能并未發(fā)生改變（表2）。H組體重變化與Ach Emax呈正相關，r=0.737，P＜0.05，與 Ach EC50相關性不顯著，r=0.648，P＞0.05。

2.3 瘦素對血清6-Keto PGF1α和TXB2表達水平的影響 注射瘦素7 d后對大鼠血清中6-Keto PGF1α表達水平無影響，各組間差異無統(tǒng)計學意義，但高濃度瘦素組血清TXB2水平顯著升高。各組TXB2/6-Keto PGF1α比值未見統(tǒng)計學差異。見表3。

3 討論

瘦素是一種作用廣泛的內分泌激素，除抑制攝食外，還有調節(jié)免疫、炎癥、造血等生物學效應[1]。研究發(fā)現，在離體實驗中，瘦素通過促進平滑肌肥大[8]、上調內皮素-1[9]及醛固酮表達[10]等方式參與高血壓的發(fā)病。在活體實驗中不斷發(fā)現，長期注射瘦素的動物通過激活交感神經[4]、氧化應激[5]、增加腎內Na+-K+-ATP酶活性[11]等方式參與高血壓的發(fā)病。但也有關于瘦素增加內皮細胞表達一氧化氮（NO）[3]、釋放內皮細胞衍生性超級化因子（EDHF）[12]從而起舒張血管作用的報道。而目前關于較長時間注射瘦素后動物內皮細胞依賴性舒張功能改變尚不明確。

表2 注射不同濃度瘦素7 d后Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對血管舒張劑EC50及Emax的改變（±s）

表2 注射不同濃度瘦素7 d后Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對血管舒張劑EC50及Emax的改變（±s）

注：Ach：乙酰膽堿；BK：緩激肽；SNP：硝普鈉；L-NAME：選擇性內皮型一氧化氮合成酶抑制劑；EC50：半大效應濃度值；Emax：最大舒張值。與PBS注射組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 例數 Ach（10-8M-10-3M） BK（10-8M-10-5M） SNP（10-9M-10-3M）EC50 Emax（%） EC50 Emax（%） EC50 Emax（%）PBS 注射組 5 -5.69±0.12 72.91±7.91 -6.51±0.21 29.99±3.80 -7.79±0.71 99.72±25.78 0.1 mg/kg leptin 注射組 5 -5.53±0.13 70.30±8.49 -6.52±0.11 29.78±5.08 -7.18±0.20 106.47±19.64 0.5 mg/kg leptin 注射組 5 -6.33±0.11a 86.11±7.59b -6.47±0.14 34.97±4.23a -7.49±0.28 101.72±16.45 0.3 mM L-NAME+BK（10-5M）Emax（%）7.31±0.43 7.89±0.78 7.83±0.95

圖3 注射瘦素7 d，Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對10-5M AA及預先孵育10-3M NS-398 30 min后加入10-5M AA收縮百分比改變

圖4 注射瘦素7 d，Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對不同濃度（10-8-10-3M）Ach的舒張功能反應

圖5 注射瘦素7 d，Wistar大鼠胸主動脈環(huán)對不同濃度（10-8-10-5M）BK的舒張功能反應

表3 注射不同濃度瘦素7 d后對Wistar大鼠血清中6-Keto PGF1α和 TXB2表達的影響（±s）

表3 注射不同濃度瘦素7 d后對Wistar大鼠血清中6-Keto PGF1α和 TXB2表達的影響（±s）

注：6-Keto PGF1α：6-酮前列環(huán)素 F1α；TXB2：血栓素 B2。與 PBS 注射組比較，aP＜0.05

TXB2/6-Keto PGF1αPBS 注射組 5 320.92±21.17 50.44±6.40 164.46±20.97 0.1 mg/kg leptin 注射組 5 312.39±24.62 50.26±7.87 168.09±25.66 0.5 mg/kg leptin 注射組 5 317.25±23.13 60.15±8.84b 191.20±33.64組別 例數 6-Keto PGF1α（pg/ml）TXB2（ng/ml）

為探討較長時間注射瘦素后大鼠動脈環(huán)對血管活性物質的反應性，本研究通過注射不同濃度瘦素后記錄進食量、體重、血壓及張力值的改變。結果顯示，低濃度瘦素注射組（0.1 mg/g）除在第2天到第4天明顯抑制大鼠進食量外，對體重、MAP、血管張力及血清6-Keto PGF1α、TXB2水平無顯著影響，表明注射低濃度瘦素僅發(fā)揮了抑制食欲、增加能量消耗以調節(jié)能量平衡的生理學效應。但在高濃度瘦素注射組中，除抑制大鼠進食量、降低體重外，還增強了內皮細胞依賴的舒張功能，這種作用主要源于增加了NO合成及釋放。原因包括：⑴高濃度瘦素注射組加強由Ach引起的舒張，而Ach主要通過eNOS產生NO引起血管舒張。⑵BK通過3種方式引起血管張[13]：①通過eNOS合成NO；②在細小血管內釋放EDHF；③通過COX-2產生前列環(huán)素PGI2。但預先孵育L-NAME（eNOS合成酶抑制劑）后瘦素加強舒張功能消失，證明高濃度瘦素注射組加強BK的舒張效應主要源于增加NO的合成，并不是通過上調COX-2表達，增加PGI2釋放，而且血清中6-Keto PGF1α水平并未升高，它是PGI2在血液中的穩(wěn)定存在形式。但本研究局限之處在于僅用了2個不同濃度瘦素進行對比研究。另外，AA對血管產生收縮或舒張作用主要取決于動物種屬及血管半徑，通過COXs將AA分解成PGI2和TXA2，舒縮作用取決于兩者的比例[14]。本研究發(fā)現AA對大鼠胸主動脈環(huán)起收縮作用，證明TXA2占主要作用地位。但注射瘦素后動脈環(huán)對AA、NS-398+AA引起的收縮并無影響，通過孵育NS-398后各組收縮百分比均下降10%左右，證明外源性AA通過COX-2分解成TXA2約占50%。但注射瘦素后并不能通過誘導內皮細胞中COX-2表達改變AA收縮百分比。另外本研究發(fā)現，高濃度組TXB2水平升高，原因可能在于TXB2可由血小板產生，當收集血液后未及時進行離心時會升高。而且在臨床上也有報道，高瘦素血癥肥胖婦女的血、尿液中11-脫氫血栓素B2表達升高[15]，后者也是TXA2的穩(wěn)定代謝物。所以有足夠理由相信，較長時間注射高濃度瘦素能上調動物血小板表達血栓素A2，增加血小板的聚集。

與本研究不同的是Manuel-Apolinar等[16]發(fā)現瘦素能上調大鼠內皮細胞 COX-2 mRNA表達，而本研究在細胞實驗中發(fā)現除此作用外，瘦素還能顯著上調大鼠主動脈內皮細胞的COX-2蛋白表達，升高6-Keto PGF1α水平并降低TXB2/6-keto PGF1α比例，但對TXB2無影響。說明瘦素可能通過增加COX-2、PGI2表達以增強內皮細胞依賴的舒張功能。雖然在體內我們發(fā)現瘦素并沒有升高6-Keto PGF1α水平、降低 TXB2/6-keto PGF1α比例，甚至相反上調血小板表達TXB2，但是在離體動脈環(huán)中證實瘦素的確能增加內皮細胞依賴性舒張功能。這與細胞實驗總的結果是一致的，即從細胞實驗中由各種檢測指標推測瘦素能增強動脈舒張功能，并由此動脈環(huán)實驗得到了驗證。至于瘦素對COX-2及其下游產物6-Keto PGF1α和TXB2表達有所差異，筆者認為與使用瘦素濃度不一致、注射方式、瘦素代謝速度及體內有眾多因素參與（例如血小板）等有關，這些需要在今后的研究中進一步探討。另外，本研究中各組MAP隨注射時間均有升高趨勢，但各組間比較未見統(tǒng)計學差異。原因可能在于：①年齡增長；②反復注射和測量各項指標使動物較長時間處于應激狀態(tài)。使血壓升高可能需要更高濃度瘦素或改變注射方式[4]。

在本研究中高濃度瘦素組由Ach、BK引起的舒張加強，由于Ach主要通過eNOS產生NO引起血管舒張，并且瘦素加強BK的舒張作用被LNAME所抑制，從而證明瘦素增強內皮細胞依賴的舒張功能與NO有關[17]。盡管瘦素增加了血小板縮血管物質TXB2的表達[18]，對舒血管物質PGI2的穩(wěn)定形式6-Keto PGF1α表達水平無影響，但綜合效應是增強血管的舒張功能。另外，高濃度瘦素組體重變化與Ach Emax呈正相關，說明瘦素增強血管的舒張功能與體重減輕有關。

綜上所述，本研究探討較長時間注射瘦素后動物血管張力改變及其影響因素。結果發(fā)現，瘦素能增強由NO介導的內皮細胞依賴的舒張功能，與通過COX-2產生PGI2的途徑無關。同時也證實注射瘦素后，大鼠攝食量明顯減少，體重減輕，體重下降有助于改善內皮細胞舒張功能[19]，這為減肥防治高血壓提供了客觀依據。

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Effect of leptin on rat vascular tone and mechanism studies

CHEN Yue-lin，SHEN Yue-chun.Department of Cardiology，First Affiliated Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China

SHEN Yue-chun，E-mail：shenyc102806@163.com

ObjectiveTo explore the effects of leptin injection on Wistar rats′thoracic aortic rings vascular tension changes and its influencing factors.MethodsFifteen male wistar rat were divided into 3 groups：⑴PBS control group（C）.⑵0.1 mg/kg low concentration of leptin injection group（L）.⑶0.5 mg/kg high concentration of leptin injection group（H），were injected for 7 days respectively.Daily food intake，body weight changes and mean arterial pressure（MAP）were recorded of each groups.The thoracic aortic rings contraction responses to variety vasoactive mediators were tested.Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect serum 6-Keto prostaglandin F1α（6-Keto PGF1α）and thromboxane B2（TXB2）level.ResultsInjection of leptin significantly inhibited daily food intake on the next day［H（21.75±2.41）g vs L（23.84±0.74）g vs C（28.54±1.15）g].At the beginning of the fourth days body weight significant lose only in H group［H（259.25±9.31）g vs C（272.75±12.92）g，P＜0.05]，and last to 7 days［H（257.5±7.96）g vs C（281.25±11.28）g，P＜0.01].Comparing with C group，L and H group had no significant increase MAP［H（80.73±5.56）mm Hg vs L（83.45±7.47）mm Hg vs C（84.53±2.17）mm Hg，P＞0.05]，as well as contraction responsed to vasoconstrictor，such as phenylephrine and arachidonic［10-3M phenylephrine contraction，H（133.64±26.06）%vs L（146.98±20.34）%vs C（140.91± 22.17）%，P＞0.05；10-5M arachidonic contraction，H（22.52±1.55）%vs L（23.78±2.43）%vs C（22.76±1.1）%，P＞0.05].H group separately improved response to endothelial-dependent vasodilator agents mediated by nitric oxide（NO）：acetylcholine（Ach）and bradykinin（BK）and decreased Ach concentration for 50%maximal effect（EC50）［H（-6.33±0.11）vs C（-5.69±0.12），P＜0.05].Leptin potentiated vasorelaxation induced by BK，which was inhibited by L-NAME（selective endothelial nitric oxide synthase inhibitor）.H group body weight changes was positively correlated with the Ach percentage of maximal relaxation effect（Emax）（r=0.737，P＜0.05）.Furthermore，H group increased the serum TXB2level［H（60.15±8.84）ng/ml vs C（50.44±6.4）ng/ml，P＜0.05].ConclusionLong term injection of leptin although increases vasoconstrictors TXB2expression by platelet，but the final effection of leptin is enhancing arterial endothelial dependent vasorelaxation，which is not related to vasodilatation substance 6-Keto PGF1αbut to increasing endothelial cells expression of NO，decreasing food intake resulting in body weight lose and improving endothelial diastolic function.Current results provide an evidence that body weight lose is benefit to prevention and control of hypertension.

Leptin； Endothelial cell； COX-2； Prostacyclin； Thromboxane； Vascular tone

2010年度廣東省自然科學基金面上項目（項目編號：10151009504000007）

510120 廣東省廣州市，廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內科

沈粵春，E-mail：shenyc102806@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．021

Q95-33；R54

A

1672-5301（2015）08-0754－06

2015-05-07）