直接擴(kuò)增法提取脫落細(xì)胞DNA

泉州市公安局 焦 志

1 材料和方法

1.1 樣本

所用樣本均來自日常案件檢材。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

（1）主要試劑：Identifiler Plus擴(kuò)增試劑盒，M48核酸純化試劑盒。

（2）主要儀器：PE9700型DNA擴(kuò)增儀，ABI3130XL遺傳分析。

1.3 DNA的提取

工具類等具有光滑表面的樣本采用棉簽兩步擦拭法擦取，剪取一半放入八連管中，另一半放入1.5mL離心管中。

手套類樣本采用 EZ-tape粘取，剪取一半濾膜放入八連管中，另一半放入1.5mL離心管中，按照M48核酸純化試劑盒的操作手冊進(jìn)行DNA提取。

1.4 PCR擴(kuò)增

放入八連管中的檢材（其中兩步擦拭法的棉簽適當(dāng)在PE9700型DNA擴(kuò)增儀上56℃進(jìn)行烘干）按照Identifiler Plus試劑盒的操作手冊進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系總體積以蓋過檢材為準(zhǔn)。經(jīng)過M48核酸純化試劑盒提取的DNA樣本，PCR反應(yīng)體系總體積為10μL。

1.5 STR分型檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，在ABI3130XL遺傳分析儀上完成。

2 結(jié)果和討論

從表1可以看出，對于工具類檢材，M48提取、直接擴(kuò)增兩種方法的檢出率分別為50%、60%，其中有5份檢材直接擴(kuò)增法檢出而M48提取未檢出。對于固相物體表面擦拭物檢材，M48提取、直接擴(kuò)增兩種方法的檢出率分別為30%、50%，其中有2份檢材直接擴(kuò)增法檢出而M48提取未檢出。對于這兩類檢材，直接擴(kuò)增法的檢出率都要高于M48法。從表2可以看出，直接擴(kuò)增法提取檢出、M48提取未檢出的檢材樣本15個基因座都得到了完整的分型，熒光檢測信號均值在100～500RFU之間。對于這兩類檢材M48的提取需要裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫這四個步驟，檢材裂解完畢后需要吸取上清到一新的離心管中進(jìn)行結(jié)合階段，換管的過程中必然存在著 DNA模板的損失。在洗滌階段，大量多次的洗滌雖然可以去除大部分的雜質(zhì)等影響擴(kuò)增的因素，但也會不可避免存在 DNA模板的或多或少的損失，在洗脫階段同樣存在洗脫率的問題。這些因素都會造成檢材樣本模板的損失，對于低拷貝模板的檢材顯得尤為重要，以致這些檢材得不到正確的分型結(jié)果或者沒有分型結(jié)果。直接擴(kuò)增法在處理同樣檢材樣本特別是對于模板量很小的檢材時，由于幾乎不需要提取，直接將檢材放入八連管進(jìn)行擴(kuò)增，減少了多步驟提取在時間和過程中對于模板 DNA的損失，最大程度保留了模板DNA。因此對于工具類、固相物體表面擦拭物這兩類檢材，在檢材表面相對比較潔凈的情況下，直接擴(kuò)增法相比M48法具有更好的效果。對于手套類檢材，從表1可以看到，M48提取、直接擴(kuò)增兩種方法的檢出率分別為80%、47%，其中有5份檢材M48提取檢出而直接擴(kuò)增法未檢出。

表2結(jié)果表明，M48提取檢出而直接擴(kuò)增法未檢出檢材樣本15個基因座都得到了完整的分型，熒光檢測信號均值在100～300RFU之間，M48法的檢出率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于直接擴(kuò)增法。究其原因是由于手套類檢材提取使用 EZ-tape粘取法粘取手套，粘膜表面粘取的雜質(zhì)較多，而且粘膜載體較大，粘膜性狀也比較特殊，而且直接擴(kuò)增法體系相對較小，檢材大小、表面潔凈程度都會影響到后續(xù)的直接擴(kuò)增。而M48法對于這類檢材可以起到純化的作用，通過洗滌過程可以去除影響擴(kuò)增的大部分雜質(zhì)，得到相對純凈的 DNA模板，大大提高了檢出的成功率。

表1 直接擴(kuò)增法、M48提取法檢驗(yàn)結(jié)果之間的對比

表2 M48提取檢出直接擴(kuò)增法未檢出、直接擴(kuò)增法檢出M48提取未檢出STR檢驗(yàn)結(jié)果之間的對比

表3結(jié)果表明，兩種方法檢出數(shù)檢材15個基因座都得到了完整的分型，熒光檢測信號均值大體在100～3000RFU之間，直接擴(kuò)增法等位基因峰高略大于M48法。在時間方面，直接擴(kuò)增法具有非常大的優(yōu)勢，12個樣本提取時間只需要15分鐘左右，而M48需要140分鐘。在試劑的消耗方面，由于直接擴(kuò)增法的體系取決于檢材的大小、性狀，本實(shí)驗(yàn)最大體系為50μL，相對于標(biāo)準(zhǔn)的10μL體系，費(fèi)用的消耗會比較大。

表3 直接擴(kuò)增法、M48提取法在提取時間、試劑成本、STR檢測結(jié)果之間的對比

綜上所述，對于表面相對潔凈，雜質(zhì)較少的檢材比如工具類檢材樣本、固相物體表面擦拭物檢材樣本，可以采用直接擴(kuò)增法，節(jié)省大量的時間，獲得更高的檢出成功率，但需要付出成本高的代價。對于表面雜質(zhì)較多，載體相對較大的檢材，M48純化則是不錯的選擇。而對于模板量很少、雜質(zhì)相對較少的檢材樣本，直接擴(kuò)增法檢出率要高于M48法。

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