紀(jì)瑞慶，劉愛國，*，陳　龍，吳子健，胡兆博，劉　斌

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津市食品研究所，天津301609；3.天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

魚類抗凍蛋白結(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

紀(jì)瑞慶1，劉愛國1，*，陳龍1，吳子健1，胡兆博2，劉斌3

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津市食品研究所，天津301609；3.天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

抗凍蛋白通過不可逆附著于冰特定表面來有效抑制冰晶生長和重結(jié)晶，具有很強(qiáng)的抗凍活性。本文選取若干代表性魚類抗凍蛋白為例，闡述6類魚類抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)特性（氨基酸殘基組成與特定序列、二級結(jié)構(gòu)組成以及蛋白的空間構(gòu)象等）、穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的重要因素以及分子中參與冰晶結(jié)合的氨基酸殘基位點(diǎn)，重點(diǎn)揭示蛋白結(jié)構(gòu)與抗凍活性的內(nèi)在關(guān)系，以期為將來的廣泛應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

魚類抗凍蛋白；結(jié)構(gòu)；抗凍活性；吸附冰晶性能

AFP應(yīng)用于冰淇淋生產(chǎn)中，消除產(chǎn)品的冰渣感覺，改善品質(zhì)與口感，并得到了美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的認(rèn)可。2006年我國曾公布抗凍蛋白可以作為新的食品添加劑添加到冷凍食品中，由于未出現(xiàn)此類產(chǎn)品在食品工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用，在2012年未被列入食品添加劑列表中。迄今為止，按生物體來源的不同，已發(fā)現(xiàn)的AFP可分為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、細(xì)菌抗凍蛋白。其中對于魚類AFP（特別是源于極地魚類機(jī)體的AFP）的研究比較透徹，魚類AFP按照結(jié)構(gòu)可分為6類（圖1）［5］：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）、高活性抗凍蛋白。

圖1　6種魚類抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖［5］5Fig.1Structural illustration for six kinds of fish antifreeze pro teins［5］

AFP的結(jié)構(gòu)與其抗凍活性具有十分密切的關(guān)系。通常在凍結(jié)溫度下溶液中的水會形成冰晶結(jié)構(gòu)，但當(dāng)AFP存在時(shí)，情況就會發(fā)生變化：一方面，AFP會不可逆地附著到冰晶特定的表面并成為冰晶的一部分，可阻止其他水分子在冰晶表面的吸附，也可掩蔽那些能成為異質(zhì)冰核的存在位點(diǎn)；另一方面，AFP在冰晶表面的附著會致使吸附蛋白間的冰按照彎曲鋒面生長，此處表面張力加大改變了原有水分子結(jié)晶形成冰所需的能量平衡狀態(tài)，使得冰在此進(jìn)一步生長延伸所需能量無法滿足，這就是開爾文效應(yīng)（Kelvin effect）。在此過程中，溶液的冰點(diǎn)降低，而熔點(diǎn)幾乎保持不變，熔點(diǎn)與降低之后的冰點(diǎn)之間產(chǎn)生的差值即為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）［6］。以上就是AFP具有抑制冰晶生長及重結(jié)晶活性（ice growth and recrystallization inhibition activity）［7］的原因，而THA也被用作衡量抗凍蛋白抗凍活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。AFP不可逆地附著到冰晶的表面是AFP具有抗凍活性的關(guān)鍵，而AFP在冰晶表面的有效附著是AFP與冰晶表面相互作用的結(jié)果，在此過程中，AFP的結(jié)構(gòu)，特別是特定區(qū)域的結(jié)構(gòu)以及與冰面結(jié)合的氨基酸殘基位點(diǎn)起到了十分重要的作用。當(dāng)然目前不同來源的抗凍蛋白結(jié)構(gòu)多樣，它們的氨基酸殘基序列以及與冰晶結(jié)合的相關(guān)結(jié)構(gòu)域所形成的構(gòu)象沒有一致性，且有些AFP蛋白在低溫下還會發(fā)生構(gòu)象改變［8］，造成了目前用構(gòu)象來判斷蛋白質(zhì)是否屬于AFP具有一定困難和不確定性，但對AFP晶體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探索以及與冰晶體結(jié)合位點(diǎn)的確定可以幫助研究人員深入理解AFP與冰晶結(jié)合的機(jī)制。本文擬通過總結(jié)目前已經(jīng)報(bào)道的6種魚類AFP的結(jié)構(gòu)及其與冰晶結(jié)合的機(jī)制，揭示魚類AFP的結(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系，期望能從蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)的角度分析討論魚類AFP具有抗凍活性的內(nèi)在原因。

1?、裥涂箖龅鞍椎慕Y(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

Ⅰ型抗凍蛋白（typeⅠAFP）是一類結(jié)構(gòu)最簡單的魚類AFP，通常含有約40個(gè)氨基酸殘基，且富含丙氨酸殘基（約＞60%，如圖2所示）［9］，分子質(zhì)量約為3.3～4.5ku，其空間結(jié)構(gòu)（圖1b）具有高度或完全α-螺旋化，THA約為0.7℃。該類蛋白發(fā)現(xiàn)于美洲擬鰈魚（winter flounder，拉丁名Pseudopleuronectes americanus）、短角杜父魚（shorthorn sculpin，拉丁名Myoxocephalus corpius）［10］的血清和皮膚等組織中，在機(jī)體中含量極低，通常為10～15mg/mL。該類蛋白吸附在六棱雙金字塔形冰晶（hexagonal ice）沿<011-2>方向的｛202-1｝錐面上。

圖2Ⅰ型抗凍蛋白的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［11］11Fig.2Amino acid sequence f or the primary structure of type I AFP［11］

美洲擬鰈血清中發(fā)現(xiàn)的HPLC-6就是一種典型的Ⅰ型抗凍蛋白，分子質(zhì)量3.3ku，由37個(gè)氨基酸殘基組成（圖2a），且包含3個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)序列單元（Thr-Al a-Ala-X-Ala-X-X-Ala-Ala-X-X，其中X為任意氨基酸殘基），含23個(gè)丙氨酸殘基（62%）且多成簇排列，此氨基酸易形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，疏水性氨基酸殘基（如丙氨酸殘基、亮氨酸殘基）約占67.6%，親水性氨基酸約占32.4%。HPLC-6空間結(jié)構(gòu)幾乎完全由雙親右手α-螺旋構(gòu)成，只有C端的最后一個(gè)螺圈為310螺旋。HPLC-6上N端和C端各自含有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，維系著整個(gè)分子螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（圖3a），其中N端帽子結(jié)構(gòu)上的Asp1、Thr2、Ser4以及Asp5殘基側(cè)鏈和兩個(gè)緊密結(jié)合的水分子間的8個(gè)氫鍵構(gòu)成一個(gè)有序的氫鍵網(wǎng)絡(luò)；而C端帽子結(jié)構(gòu)由Arg37殘基側(cè)鏈和酰胺化羧基端形成的3個(gè)氫鍵組成［11-12］。HPLC-6分子沿著螺旋軸向方向形成3個(gè)面（圖3b）：1）疏水面，由丙氨酸和蘇氨酸殘基的甲基組成；2）親水面，由精氨酸殘基、谷氨酸殘基、絲氨酸殘基和天冬酰胺殘基組成；3）Thr-Asx面，主要由蘇氨酸殘基和天冬酰胺/天冬氨酸殘基的親水性基團(tuán)組成［13］。這種結(jié)構(gòu)使得分子上的4個(gè)蘇氨酸殘基（Thr2、Thr13、Thr24和Thr35）等間距排列于疏水面和Thr-Asx面之間的棱邊上（圖3c）［14］。

圖3HPLC-6蛋白的構(gòu)象示意圖［13］13Fig.3Schematic diagram of HPLC-6［13］

HPLC-6的構(gòu)象可以清晰地表明Ⅰ型AFP分子中連續(xù)完整螺旋化結(jié)構(gòu)與該類抗凍蛋白的抗凍活性有密切關(guān)系。首先，Ⅰ型AFP螺旋構(gòu)象的長度是決定其抗凍活性強(qiáng)弱的重要因素，長度越長則THA越高，抗凍活性越強(qiáng)，HPLC-6含有3個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)序列單元，形成了約10個(gè)α-螺旋圈和1個(gè)310螺旋圈，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，其THA為0.68℃，而同樣來源于美洲擬鰈魚的AFP9亞型蛋白則含有4個(gè)由11個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)序列單元（圖2b），因此其所含螺旋圈數(shù)高于HPLC-6，在質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，AFP9亞型蛋白的THA為1.0℃［16］。這種特點(diǎn)的潛在原因在于AFP是通過吸附冰晶來抑制冰晶的生長，而Ⅰ型AFP的螺旋構(gòu)象正是其與冰晶表面相結(jié)合匹配重要因素，提高螺旋結(jié)構(gòu)的長度或者說增加重復(fù)序列的數(shù)目（即增加了螺旋圈數(shù)）也就增加了Ⅰ型AFP與冰晶相作用的面積。其次，HPLC-6吸附于冰晶的椎體平面（pyramidal plane）［17］，而Ⅰ型AFP中沿著螺旋軸向方向形成3個(gè)面中至少有一個(gè)面是與冰晶結(jié)合的結(jié)合面。最初Ⅰ型AFP-冰晶結(jié)合理論認(rèn)為Thr—Asx面是蛋白與冰晶結(jié)合的結(jié)合面，而分子中Thr殘基與水分子所形成的氫鍵是結(jié)合的主要驅(qū)動力。但是近年來越來越多的研究結(jié)果指出由Ala和Thr殘基上的甲基所形成的疏水面才是蛋白與冰晶吸附的結(jié)合面，該面上的氨基酸殘基（Thr、i+4Ala、i+8Ala）為冰晶結(jié)合位點(diǎn)，主要的證據(jù)來自于：Zhang Wei等［18］利用突變體實(shí)驗(yàn)證明HPLC6上蘇氨酸殘基的甲基對其與冰晶結(jié)合能力至關(guān)重要；Baardsnes等[19]通過的突變體實(shí)驗(yàn)表明Ala17和Ala21位于HPLC-6與冰晶結(jié)合區(qū)域；Mao Yougang等[20]證實(shí)Ala殘基上的甲基作用于冰水界面的冰晶表面，并且推斷Ⅰ型抗凍蛋白皆含有一個(gè)富丙氨酸殘基的α-螺旋結(jié)構(gòu)，且這些丙氨酸殘基又進(jìn)一步形成一個(gè)疏水性的冰晶結(jié)合平面，而α-螺旋親水面上的極性氨基酸殘基可提高AFP的溶解性。另外，Thr-Asx面上的Leu殘基可防止AFP在生理質(zhì)量濃度（10mg/mL）下聚集，Asn殘基可提高HPLC-6的溶解性[21]；Lys18與Glu22間的鹽橋雖不會影響抗凍活性，但可穩(wěn)定蛋白的構(gòu)象，并且鹽橋數(shù)量的增加也可增加蛋白的溶解性[22]。

2?、蛐涂箖龅鞍捉Y(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

Ⅱ型抗凍蛋白（typeⅡAFP）是一類富含半胱氨酸殘基的魚源抗凍蛋白，發(fā)現(xiàn)于鯡魚、胡瓜魚等的血清中，分子質(zhì)量范圍為11～24ku，THA約為0.13℃。根據(jù)其吸附冰晶是否依賴Ca2+的參與，Ⅱ型AFP又可分為兩種亞型：Ca2+依賴亞型與Ca2+不依賴亞型。但這兩種亞型的Ⅱ型AFP構(gòu)象極其相似，其中Ca2+有助于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的穩(wěn)定[23]。該類蛋白通過吸附冰晶的｛101-0｝棱面從而顯示出其抗凍活性。

圖44源于Clupea harenngguuss的AFP的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［2233］Fig.4Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Clupea harengus［23］

大西洋鯡魚抗凍蛋白（herring antifreeze protein，拉丁名Clupea harengus，hAFP）是一種由130個(gè)氨基酸殘基（Ala1～Lys130），如圖4所示，構(gòu)成的Ⅱ型Ca2+依賴亞型的抗凍蛋白中疏水性氨基酸約占36.9%，親水性氨基酸約占63.1%；所含的10個(gè)半胱氨酸殘基形成5對二硫鍵（Cys4～Cys15，Cys32～Cys125、Cys69～Cys100、Cys89～Cys111、Cys101～Cys117）；整個(gè)分子構(gòu)象類似于Rossman折疊結(jié)構(gòu)域（Rossman fold domain），如圖5a所示，8條β-折疊股（β1，aa9～11；β2，aa14～23；β3，aa38～39；β4，aa62～67；β5，aa76～77；β6，aa101～106；β7，aa111～115；β8，aa121～128）構(gòu)成扭曲居中的反向平行β-折疊，兩側(cè)各排列一個(gè)α-螺旋（α1，aa25～33；α2，aa45～53）；分子中參與Ca2+結(jié)合的區(qū)域位于Gln92～Asp114之間的無規(guī)則卷曲，即：“Ca2+結(jié)合環(huán)”（Ca2+-binding loop），其中的Gln92Oε1、Asp94Oδ2、Glu99Oε1、Asn113Oδ1、Asp114O和Oδ1與Ca2+形成配位鍵（圖5b）。

圖5hAFP的構(gòu)象示意圖［24］24Fig.5Schematic representation of AFP structure［24］

hAFP吸附冰晶并抑制冰晶生長的因素在于：首先，Thr96、Thr98、Asp94和Glu99是hAFP與冰晶進(jìn)行有效吸附的結(jié)合位點(diǎn)［24］，天然狀態(tài)下，這些氨基酸殘基共同形成一個(gè)較平坦的平面，并受到“Ca2+結(jié)合環(huán)”兩側(cè)二硫鍵（Cys69～Cys100與Cys89～Cys111）的穩(wěn)定作用，該平面能與冰晶晶格表面有效吸附，并抑制冰晶的生長［25］；另一個(gè)方面，“Ca2+結(jié)合環(huán)”上配位結(jié)合的Ca2+不僅穩(wěn)定了hAFP蛋白構(gòu)象，更協(xié)同加強(qiáng)了hAFP與冰晶的相互作用，當(dāng)?shù)鞍着c冰晶作用時(shí)，與Ca2+配位相連的有序水分子也可成為生長冰晶的一部分。

薩哈林小眼八角魚抗凍蛋白（longsnout poacher antifreeze protein，拉丁名Brachyopsis rostratus，LpAFP）是由127個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單亞基蛋白，屬于典型的Ⅱ型Ca2+不依賴亞型的抗凍蛋白，疏水性氨基酸殘基約占42.8%，親水性氨基酸殘基約占57.2%；所含的10個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成了5對二硫鍵（Cys4～Cys15、Cys32～Cys122、Cys66～Cys97、Cys86～Cys108、Cys98～Cys114），其一級結(jié)構(gòu)如圖6所示。LpAFP的分子構(gòu)象與hAFP相似［26］，類似于Rossman折疊模式（Rossman fold）（圖7）。整個(gè)分子的二級結(jié)構(gòu)包括2個(gè)α-螺旋（α1，aa25～34；α2，aa45～54）、8個(gè)β-折疊股（β1，aa9～11；β2，aa14～22；β3，aa38～39；β4，aa59～64；β5，aa73～74；β6，aa98～102；β7，aa109～112；β8，aa118～125）以及4個(gè)環(huán)區(qū)（L1，aa66～72；L2，aa74～78；L3，aa86～89；L4， aa91～97），其中L3、L4以及β7、β6的C端、β4的N端及其周圍氨基酸殘基組成較平坦的平面，此平面又被分為兩部分：疏水區(qū)（連接二級結(jié)構(gòu)的無規(guī)則片段：Gly57～I(xiàn)le58、Ala103～Ala104、Pro113～His118）和親水區(qū)（環(huán)區(qū)和β-折疊股）。以Ile58為中心的疏水區(qū)是吸附冰晶的位點(diǎn)，此區(qū)與冰晶晶格匹配而緊密結(jié)合。Ile58周圍發(fā)現(xiàn)含有有序的碳原子（Ile58的Cδ、Ala103的Cβ、His118的Cε），這與Doxey等［27］報(bào)道AFP的冰結(jié)合區(qū)域中有序的表面碳原子靠近極性原子一致。Asn91、Asp110、Asp111（對應(yīng)于結(jié)合Ca2+的氨基酸殘基）與一個(gè)水分子形成氫鍵，與二硫鍵Cys66～Cys97、Cys86～Cys108一起維持環(huán)區(qū)的構(gòu)象穩(wěn)定。

圖66源于Brachyopsis rostraattuuss的AFP的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［2233］Fig.6Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Brachyopsis rostratus［23］

圖7lpAFP的整體折疊構(gòu)象［26］26Fig.7Overall folding of longsnout poacher lpAFP［26］

3　3Ⅲ型抗凍蛋白結(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

Ⅲ型抗凍蛋白（typeⅢAFP）是一類分子質(zhì)量約為7.0ku（6.5～7.14ku）的球蛋白（圖8a），THA一般為0.53℃。該類蛋白的兩個(gè)端瓣（N端瓣和C端瓣）各含有一個(gè)由若干不完全的短β-折疊股形成的β-片層，兩個(gè)β-片層間夾著一段只有一個(gè)螺旋圈的α-螺旋；主鏈內(nèi)許多“類似β-結(jié)構(gòu)”的β-股間氫鍵使得整個(gè)蛋白折疊緊密并具一定剛性（圖1、8）；蛋白構(gòu)象中含有能與冰晶表面（棱面或錐面）相互作用的平坦面，此面與晶格的棱面上氧原子形成互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)，并且還與錐面互補(bǔ)，形成六方雙錐體冰晶。蛋白表面通過氫鍵識別冰晶的結(jié)合面，互補(bǔ)性的結(jié)構(gòu)允許冰晶-蛋白之間范德華力相互作用，加強(qiáng)冰晶-蛋白的相互吸引力，使得蛋白更好的吸附冰晶。

美國大綿鳚（eel pout，拉丁名Macrozoarces americanus）含有12種Ⅲ型抗凍蛋白，分別為HPLC-1～HPLC-12，目前研究比較透徹的是HPLC-12。HPLC-12具有典型的Ⅲ型抗凍蛋白的空間構(gòu)象，也屬于季銨基乙基-葡聚糖凝膠結(jié)合型（quaternary aminoethyl（QAE）-sephadex-binding group）Ⅲ型抗凍蛋白，即QAE型[28]。該蛋白含有66個(gè)氨基酸殘基，其N端瓣和C端瓣各含有一個(gè)β-片層（每個(gè)片層各含3股β-折疊股）（圖8a），aa3～7、aa15～17、aa22～26、aa43～45、aa53～54、aa60～62分別形成6段不完整的β-折疊股；37～40aa為短的α-螺旋［29］。不過也有觀點(diǎn)認(rèn)為33～43aa形成5個(gè)β-轉(zhuǎn)角，而33～37aa和36～40aa間連續(xù)的兩兩轉(zhuǎn)角分別形成兩個(gè)310-螺旋［30］。不同溫度條件下，該蛋白的構(gòu)象基本不變［30］。

目前，對該蛋白與冰晶相互作用并結(jié)合的機(jī)制解釋有兩種理論：1）單個(gè)雙親冰晶結(jié)合平面理論［29］，該理論的提出較早，HPLC-12含有一個(gè)能與冰晶基本棱面（primary prism plane，PPP）吸附的擬平行四邊形平面（pseudo-parallelogram），其中Thr18和Ala16的羰基以及Gln44相連形成擬平行四邊形的一條邊，而Gln9和Thr15形成了平行的另一條邊，兩邊相距4.5?，并且該面被鄰近的一些疏水性氨基酸殘基（Leu10、Pro12、Ile13、

Leu19、Val20、Val41以及Leu51）圍繞；擬平行四邊形上的Gln9、Thr15和Thr18側(cè)鏈上的氧原子、Gln44側(cè)鏈上的氮原子以及Ala16的主鏈氧原子共同形成與冰晶表面水分子直接作用的平坦平面（圖8b），且這5個(gè)原子間的距離與冰晶棱面水分子上氧原子的間距完全匹配；正是這些關(guān)鍵原子和冰晶表面氧原子之間的氫鍵作用使得HPLC-12能沿著六棱形冰晶的中心軸（即C軸）方向與冰晶棱面結(jié)合。2）復(fù)合冰晶結(jié)合平面型理論［31］，該理論目前較為流行，HPLC-12的分子質(zhì)量雖然只有7.0ku，卻擁有兩個(gè)能與冰晶上平行于冰晶C軸或稍微傾斜的表面（即所吸附冰晶的棱面和所吸附冰晶的錐面）同時(shí)相互吸附的平面，兩個(gè)面相鄰呈150°，且均位于蛋白上較為疏水的區(qū)域（圖8c），其中Thr18、Leu19、Val20、Val41組成的平面與PPP吸附，而Gln9、Leu10、Ile13、Asn14、Thr15、Ala16、Met21和Gln44負(fù)責(zé)其與冰晶錐面的吸附作用。

圖8Ⅲ型AFP的構(gòu)象和復(fù)合冰晶吸附位點(diǎn)示意圖Fig.8Schematic representation of AFP structure

4?、粜涂箖龅鞍捉Y(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

Ⅳ型抗凍蛋白（typeⅣAFP）是一類具有四螺旋捆結(jié)構(gòu)域（由4個(gè)反平行左手α-螺旋組成）的抗凍蛋白，如圖1e所示。其分子質(zhì)量約為Ⅰ型抗凍蛋白的3倍左右，大約為12.0ku，富含谷氨酸殘基（17%），THA較低，一般為0.08～0.5℃。此類蛋白吸附在對稱于垂直C軸的一個(gè)軸兩側(cè)，呈香腸型的吸附面積，使得冰晶呈扭曲的六方雙錐體（hexagonal bipyramid），即六方偏方面體（hexagonal trapezohedra）。

長角杜父魚（longhorn sculpin，拉丁名Myoxocephalus octodecimspinosis）血清中分離的LS-12是最早發(fā)現(xiàn)的Ⅳ型抗凍蛋白，其一級氨基酸殘基序列如圖9所示，分子質(zhì)量為12.3ku，由108個(gè)氨基酸殘基組成，含11個(gè)谷氨酸殘基（約10.1%）和17個(gè)谷氨酰胺殘基（約15.7%），疏水性氨基酸殘基約占41.6%，親水性氨基酸殘基約58.4%，N端含有一個(gè)焦谷氨酰基團(tuán)；其空間構(gòu)象高度螺旋化，具有典型的四螺旋捆（four-helix bundle）結(jié)構(gòu)域（圖10），每個(gè)螺旋的疏水側(cè)鏈居于各螺旋間并形成疏水核心，而親水側(cè)鏈則位于旋捆的外表面，可與冰晶表面形成特異性吸附［32］。當(dāng)LS-12蛋白存在時(shí)，形成的冰晶結(jié)構(gòu)呈六方偏方面體，而不是常見的六方雙錐體，冰蝕刻實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它并不吸附六方雙錐體棱面（如美洲擬鰈AFP）和第二棱面（如短角杜父魚AFP），而是吸附在對稱于垂直C軸的一個(gè)軸兩側(cè)，因此冰晶形態(tài)不同于其他抗凍蛋白［33］。

圖99源于Myoxocephalus octodecimspinoossiiss的AFP的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［3322］Fig.9Amino acid sequence for the primary structure of AFP from Myoxocephalus octodecimspinosis［32］

圖1　0LS-12的結(jié)構(gòu)示意圖［33］33Fig.10Schematic representation of LS-12structure［33］

通常Ⅳ型抗凍蛋白在宿主機(jī)體中的含量極低，如LS-12在宿主機(jī)體內(nèi)的質(zhì)量濃度僅為100μg/mL，機(jī)體并沒有產(chǎn)生足夠數(shù)量的AFP保護(hù)宿主防凍［34］，對于Ⅳ型抗凍蛋白的功能仍存在爭議，但目前認(rèn)為它可能含有抗凍活性，并且除了結(jié)合冰晶的功能外還可能具有結(jié)合配體的功能。此外，發(fā)現(xiàn)該類蛋白在宿主胚胎發(fā)育的整個(gè)期間高度表達(dá)，如另一種Ⅳ型抗凍蛋白——銀鯽Ⅳ型抗凍蛋白（Carassius auratus gibelio antifreeze typeⅣprotein，CagAFPⅣ）。Liu Jingxia等［35］的研究表明，CagAFPⅣ蛋白基因的轉(zhuǎn)錄始于囊胚期，并且在整個(gè)宿主的胚胎發(fā)育期都保持高水平的表達(dá)，而其在已孵化成的幼體內(nèi)表達(dá)急劇下降。表明其可能具有保護(hù)尚未產(chǎn)生血液循環(huán)系統(tǒng)胚胎的功能，這對魚類進(jìn)化可能具有益處，使得生物機(jī)體在獲得有活性的抗凍蛋白前能夠適應(yīng)寒冷環(huán)境［36］。

5　抗凍糖蛋白結(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）是一類富含糖基的抗凍蛋白，其THA一般為1.2℃。該類蛋白的一級序列含重復(fù)的三肽單元，即Ala—Ala—Thr（圖11），其中蘇氨酸殘基的β-羥基上結(jié)合一個(gè)O-連接的二糖基團(tuán)，為β-D-吡喃半乳糖苷-（1，3）-2-乙酰氨基2-脫氧-β-D-

吡喃半乳糖（圖1a）。AFGP所含三肽單元的重復(fù)數(shù)目范圍為4～50，因此AFGP的分子質(zhì)量范圍為2.6～33.7ku。根據(jù)分子質(zhì)量的不同，AFGP可分為8種亞型，AFGP1亞型分子質(zhì)量最大，為33.7 ku，而AFPG8亞型分子質(zhì)量最小，為2.6 ku。對于AFGP的空間構(gòu)象的認(rèn)識目前沒有統(tǒng)一觀點(diǎn)，早先運(yùn)用圓二色譜和核磁共振的研究表明AFGP

的空間構(gòu)象為延展?fàn)畹臒o規(guī)則卷曲；也有研究表明它們的構(gòu)象呈有序的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，糖基排列在螺旋一側(cè)，因此其親水面含有二糖基的羥基，而疏水面包含氨基酸殘基上疏水性的甲基；但是目前多數(shù)的研究表明分子質(zhì)量較大的

AFGP1～AFGP5亞型并不具有長而有序的結(jié)構(gòu)（long-range order structure），而分子質(zhì)量很小的AFPG8亞型整體是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，但也有局部有序片段的存在［5］。

圖1　1AFGP3亞型的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［37］37Fig.11Amino acid seq uence for the primary structure of AFGP3［37］

由于通常南極魚（Antarctic notothenioid，拉丁名Notothenia coriiceps）等抗凍魚機(jī)體中含多種AFGP，并且制備單種AFGP純品非常困難，目前對AFGP抗凍機(jī)制以及它們的結(jié)構(gòu)與抗凍活性關(guān)系的研究還不夠深入。另外，迄今為止利用分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)并純化AFGP還未成功，因此目前主要通過化學(xué)合成的方法制備一定量的AFGP純品來研究各種AFGP蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系［15］。Tachibana等［38］通過液相合成了幾種AFGP的類似物，發(fā)現(xiàn)AFGP能夠具有顯著抗凍活性的主要結(jié)構(gòu)要素為：連接在每一個(gè)蘇氨酸殘基上的二糖糖基必須是α-構(gòu)象，N-乙酰基團(tuán)必須位于C2位上，二糖糖基必須是半乳糖型，蘇氨酸殘基上的α-甲基對抑制冰晶生長活性非常關(guān)鍵。糖基中的若干個(gè)羥基（除了C6位）對抗凍活性有很大影響，而主鏈的氨基酸組成對活性無明顯影響［39］。研究發(fā)現(xiàn)半乳糖基與多肽主鏈合適的距離才能保持其活性，水合作用和在凍結(jié)狀態(tài)下主軸構(gòu)象無明顯改變對冰晶抑制也有重要作用［40-41］。多肽鏈越長活性越大，一定條件下形成二聚體以及α-螺旋含量增加以及高度靈活性的構(gòu)象都會增加AFGP全部分子與冰晶的作用，允許更強(qiáng)大的吸附，而增強(qiáng)抗凍活性［42-44］。AFGP動力學(xué)研究表明其兩步抑制冰晶過程：1）不完整的吸附或改變表面較弱的作用；2）較強(qiáng)的作用實(shí)現(xiàn)完整的吸附以抑制冰晶生長。冰晶生長從一個(gè)粗糙表面形成一個(gè)平整表面，在過冷溫度下停止生長，然而之后的回復(fù)生長過程中，蛋白釋放到液相中而不是之前所認(rèn)為的成為冰晶的一部分，因此認(rèn)為抗凍行為只是純粹的動力學(xué)現(xiàn)象［45］。

6　高活性抗凍蛋白結(jié)構(gòu)與抗凍活性的關(guān)系

高活性抗凍蛋白（hyperactive antifreeze protein，HAFP）是最后一類發(fā)現(xiàn)于魚類機(jī)體中的AFP，分子質(zhì)量較其他AFP大，該類AFP在較低濃度時(shí)就能表現(xiàn)出高效的抗凍活性，其質(zhì)量濃度在4mg/mL時(shí)，THA為2℃。該類蛋白是由相同亞基組成的同源二聚體，空間構(gòu)象呈四螺旋捆（圖13a）。此類蛋白具有熱不穩(wěn)定性，在室溫條件下易分解并導(dǎo)致其抗凍活性的降低，因而這些蛋白難以在魚類中檢測出來［46］。

最早在美洲擬鰈（winter flounder，拉丁名Pseudopleuronectes americanus）中發(fā)現(xiàn)一種HAFP，被稱為Maxi。Maxi為由兩個(gè)分子質(zhì)量約為17ku的相同亞基組成的同源二聚體，如圖12所示，每個(gè)亞基均含195個(gè)氨基酸殘基，其中丙氨酸殘基含量為62%，其一級序列含有類似于Ⅰ型抗凍蛋白的由11個(gè)氨基酸殘基（Ile/ ThrXXXAlaXXXAlaXX，X為任意氨基酸殘基）組成的重復(fù)單元（圖12）。Maxi亞基由一個(gè)長約145?的螺旋-環(huán)-螺旋模體（helix-loop-helix motif）構(gòu)成，其二級結(jié)構(gòu)組成中以α-螺旋為主（含量＞95%）［47-48］，中部所含的一個(gè)Ω-環(huán)區(qū)（由每個(gè)亞基中間的7個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成）將長約290?的亞基180°對折，使得N端和C端彼此相鄰排列于亞基的一頭，且兩端各含有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)維持著螺旋構(gòu)象的穩(wěn)定性；從二級結(jié)構(gòu)的層面來說，各亞基大部分（除了中部的Ω-環(huán)區(qū)以及N端和C端的帽子結(jié)構(gòu)）是由11個(gè)氨基酸殘基重復(fù)單元序列串聯(lián)構(gòu)成的連續(xù)螺旋，每個(gè)重復(fù)單元會形成3圈螺旋（平均每3.7個(gè)殘基圍成1圈），較典型的α-螺旋（平均每3.6個(gè)殘基圍成1圈）松弛一些。Maxi二聚體的空間構(gòu)象如圖13a所示，兩個(gè)亞基空間相互并不重疊，而是以反向并列方式對齊排布（即兩個(gè)亞基的N端瓣螺旋以及兩個(gè)亞基的C端瓣螺旋分別反向比鄰排列）進(jìn)一步形成如棒狀的四螺旋捆結(jié)構(gòu)，整個(gè)分子具有一個(gè)雙重旋轉(zhuǎn)對稱軸［49-50］。整個(gè)分子的空間構(gòu)象中，亞基間緊密接觸部位主要位于各亞基的帽子結(jié)構(gòu)區(qū)域以及Ω-環(huán)區(qū)：在二聚體的一頭，一個(gè)亞基環(huán)區(qū)部位的Leu94和Tyr103與另一個(gè)亞基N端帽子上的Ile2和C端帽子上的Phe191親密接觸，形成了含有兩個(gè)芳香族側(cè)鏈堆積的局部性疏水區(qū)域（圖13b）；在二聚體的另一頭，一個(gè)亞基環(huán)區(qū)的Lys100側(cè)鏈上亞氨基與另一亞基Ala191、Ala192以及Ala194主鏈羰基形成氫鍵，而其自身的Leu94和Ile97主鏈羰基與Asn98側(cè)鏈羰基則接受來自另一亞基Arg7的氫鍵；而在二聚體中間部位，來自各亞基N端瓣螺旋的Ile51和Ile54以及C端瓣螺旋的Val144和Val148形成疏水簇。而分子中一系列重復(fù)單元所形成的螺旋區(qū)域則是依靠弱的范德華力來維系的，其結(jié)構(gòu)間隙明顯疏松（圖13c），且恰好只能容納單層的水分子，這些水分子在蛋白內(nèi)部的氨基酸殘基（多為丙氨酸殘基、蘇氨酸殘基）周圍形成伸展的五邊形水環(huán)網(wǎng)絡(luò)（polypentagonal network），如圖13d所示，當(dāng)然偶而也有一些四邊形、六邊形的水分子環(huán)。

圖1　2源于Pseudopleuronectes americaannuuss的MMaaxxii的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列［4499］Fig.12Amino acid sequence for the primary structure of HAFP from Pseudopleuronectes americanus［49］

整個(gè)蛋白分子形成一個(gè)半開放的籠型結(jié)構(gòu)（semiclathrate structure）：約400個(gè)水分子位于蛋白內(nèi)部，形成兩個(gè)彼此交叉且約呈90°的單分子水層，而另一部分水分子會溢出并延伸到蛋白的表面形成有序的水分子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而與冰面上的準(zhǔn)液體層（quasi-liquid layer）融合并一起凍結(jié)（圖13d）。此時(shí)，N端瓣螺旋和C端瓣螺旋表面上的結(jié)晶水分子簇（圖13a、13d中框內(nèi)區(qū)域）可與冰晶上多個(gè)表面匹配。此二聚體與冰晶結(jié)合的氨基酸殘基位于分子的內(nèi)部，而那些與冰面融合并一起凍結(jié)的水分子就像是從Maxi分子內(nèi)部伸出的“錨”，讓Maxi蛋白緊緊地吸附于冰晶表面，是Maxi蛋白折疊迫使水分子溢出機(jī)制與半開放籠型結(jié)合水錨定機(jī)制共同作用的結(jié)果。

圖1　3Maxi四螺旋捆結(jié)構(gòu)以及其半開放的籠型結(jié)構(gòu)示意圖［50］50Fig.13Four-helix bundle structure with an open core of HAFP［50］

7　結(jié)語

目前對于魚類AFP參與抗凍活性的關(guān)鍵因素已經(jīng)有了很深入的認(rèn)識，人們已經(jīng)能夠從分子動力學(xué)層面上解析AFP結(jié)構(gòu)與抗凍活性的內(nèi)在聯(lián)系。這些魚類AFP的氨基酸殘基組成、糖基含量、分子質(zhì)量以及空間構(gòu)象雖然有一定差異，但都具有一定的抗凍活性，都能有效地與冰晶進(jìn)行不可逆結(jié)合，并進(jìn)一步防止冰晶的生長，有的AFP具有與冰晶表面結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的平面，如：Ⅰ型抗凍蛋白、Ⅱ型抗凍蛋白、Ⅲ型抗凍蛋白；而有的AFP則通過錨定機(jī)制與冰晶結(jié)合，如HAFP；而穩(wěn)定AFP-冰晶復(fù)合物的主要作用力為疏水相互作用和范德華力。AFP具有廣泛的應(yīng)用前景，但是對于如何開放和利用AFP，仍然存在以下問題：1）目前抗凍蛋白主要是從極地魚類、陸地昆蟲、植物、細(xì)菌等生物體中分離純化得到，而這些生物機(jī)體中AFP含量很低，造成提取與分離的困難，產(chǎn)量也很低，因此亟待開發(fā)AFP的新來源；2）目前利用生物技術(shù)改造微生物，通過重組微生物的方式來表達(dá)與產(chǎn)生AFP，所得到的產(chǎn)品在應(yīng)用時(shí)存在食品安全性問題。我們有理由相信，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，以上問題可以逐步得到解決，AFP的應(yīng)用也會更加廣泛。

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Relationship between Structure and Antifreeze Activity in Fish Antifreeze Proteins

JI Ruiqing1，LIU Aiguo1，*，CHEN Long1，WU Zijian1，HU Zhaobo2，LIU Bin3
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin300134，China；2.Tianjin Food Research Institute，Tianjin301609，China；3.Tianjin Key Laboratory of Refrigeration Technology，Tianjin University of Commerce，Tianjin300134，China）

Antifreeze proteins，which possess strong antifreeze activity，can effectively inhibit ice growth and recrystallization by binding irreversibly to the ice crystal surface.The structural characteristics（including amino acid residues，specific sequences，secondary structure contents and protein spatial configuration）of six representative kinds of fish antifreeze proteins，important factors involved in stabilizing protein structure and amino-acid residue sites involved in ice binding are discussed in this paper.Much attention is focused on revealing the potential relationship between structure and antifreeze activity，and the purpose is to provide a theoretical basis for its widespread application in the future.

fish antifreeze proteins；structure；antifreeze activity；ice-binding property

R392.1

A

1002-6630（2015）05-0274-09

10.7506/spkx1002-6630-201505049抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP），又稱熱滯蛋白或冰結(jié)構(gòu)蛋白，是生物機(jī)體為適應(yīng)低溫或過冷的環(huán)境而在體內(nèi)積累產(chǎn)生的一類蛋白［1］，具有很強(qiáng)的抗凍活性，即便在較低的濃度時(shí)（較NaCl、乙二醇等抗凍物質(zhì)產(chǎn)生抗凍活性的物質(zhì)濃度要低200～500倍［2］）也會產(chǎn)生有效抗凍活性，從而使得生物機(jī)體具有耐凍（freezetolerant）以及防凍（freeze-avoidant）的性能［3］。鑒于其獨(dú)特的功能，AFP可應(yīng)用于細(xì)胞以及組織的低溫保存、制冷系統(tǒng)的冰漿、以及食物的貯藏等多方面。Bindslev-Jensen等［4］曾經(jīng)研究AFP的過敏性，發(fā)現(xiàn)其與已知的過敏原無同源性，且加入AFP后無組胺釋放，表明AFP無過敏性，是一種安全的食品添加劑；2004年聯(lián)合利華公司將

2014-09-10

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14ZCZDTC00021）；天津市科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDNC00016）

紀(jì)瑞慶（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lmx9009@126.com

劉愛國（1964—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與食品添加劑。E-mail：liuaiguo@tjcu.edu.cn