寇學(xué)良，楊東花，蘇英英，劉峰

(1.商洛市中心醫(yī)院，陜西 商洛 726000；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 咸陽 712000)

·基礎(chǔ)研究·

丹參中丹酚酸A和丹酚酸B的ESI-MS/MS裂解規(guī)律解析

寇學(xué)良1*，楊東花2，蘇英英2，劉峰2

(1.商洛市中心醫(yī)院，陜西 商洛 726000；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 咸陽 712000)

目的：使用線性離子阱傅立葉轉(zhuǎn)換串聯(lián)質(zhì)譜儀，對丹參中丹酚酸A和B進(jìn)行多級裂解分析，探析其裂解規(guī)律。方法：采用進(jìn)樣針直接進(jìn)樣的方法，使用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)裂解模式，對丹酚酸A和B進(jìn)行多級裂解分析，Xcalibar V2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對碎片離子分子式推導(dǎo)，偏差設(shè)置為20。對兩個化合物的裂解進(jìn)行初步分析，全掃描及多級碎裂掃描的分辨率為30 000，多級碎裂模式為CID，碎裂能為35%。結(jié)果：丹酚酸類化合物在多級碎裂中，主要表現(xiàn)為丹參素基的丟失，且CO和H2O的丟失也較為明顯。結(jié)論：本研究使用LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對兩個化合物裂解途徑進(jìn)行分析，探討其可能的裂解規(guī)律，為快速對中藥材中該化合物的鑒別及其代謝物的鑒別提供實驗數(shù)據(jù)支撐和思路。

丹參；高分辨；裂解

丹參為唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰的功能，常用于治療胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，瘡瘍腫痛[1]。近年來，隨著LC-MS檢測技術(shù)的發(fā)展，HPLC-MS/MS在單味藥和中藥大復(fù)方中的應(yīng)用越來越廣泛。實驗研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹酚酸A和B具有防治心血管疾病的作用[2-3]；丹酚酸A對缺血再灌注心肌具有一定的保護(hù)作用[4]，丹酚酸B對心臟缺血再灌注、腦缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用[5-6]。近年來，LC/MS/MS實現(xiàn)了從中藥中體外成分鑒定到體內(nèi)吸收成分及其代謝物的鑒定[7-9]。因此，有必要對中藥材中活性成分進(jìn)行裂解規(guī)律研究。本實驗選取兩種來自于丹參中的化學(xué)成分，使用線性離子阱傅立葉轉(zhuǎn)換串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ-Orbitrap)對其多級質(zhì)譜裂解規(guī)律做初步的分析，為快速精準(zhǔn)地在復(fù)雜體系中鑒別該兩種成分及其代謝物，提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高壓液相色譜-電噴霧-線性離子阱傅立葉轉(zhuǎn)換串聯(lián)質(zhì)譜儀(UHPLC-ESI-LTQ-Orbitrap)，Thermo Scientific ，配有電噴霧離子源(ESI)；Xcalibar 2.0工作站，分析天平。

1.2 試藥

丹酚酸A(批號：MUST-13020701，成都曼思特生物科技有限公司，CAS：96574-01-5)；丹酚酸B(批號：111562-201110，中國食品藥品檢定研究院，CAS：115939-25-8)；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI源；正負(fù)離子模式；正離子，Sheath Gas Flow rate (arb)：35，Aux Gas Flow Rate (arb)：0，Sweep Gas Flow Rate(arb)：0，I Spray Voltage (KV)：5，Capilary Temp(℃)：350，S-Lens RF Level(%)：67.7；負(fù)離子，Sheath Gas Flow rate (arb)：35，Aux Gas FlowRate(arb)：0，Sweep Gas Flow Rate(arb)：0，I Spray Voltage(KV)：4.8，Capilary Temp(℃)：350，S-Lens RF Level(%)：60.0。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別精確稱取2 mg丹酚酸A、丹酚酸B于25 mL量瓶中，用甲醇溶解，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，保存于4 ℃冰箱，備用。

2.3 方法

實驗前，分別使用對應(yīng)的校正液對正負(fù)離子模式進(jìn)行校正。使用進(jìn)樣針分別吸取200 μL左右的標(biāo)準(zhǔn)溶液，首先在正離子模式下進(jìn)樣分析，正離子模式下分析完成后，切換至負(fù)離子模式，1.5 h后相同條件進(jìn)行負(fù)離子模式下的進(jìn)樣分析。

2.4 結(jié)果

丹酚酸A和B屬于酚酸類化合物，從實驗結(jié)果可以得出，酚酸類化合物在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，因此，應(yīng)選擇負(fù)離子模式對其進(jìn)行分析。丹酚酸A的掃描范圍為m/z50～600、丹酚酸B的掃描范圍為m/z50～800。全掃描及多級質(zhì)譜(MSn)掃描分辨率為30 000；MSn碎裂方式為文獻(xiàn)使用的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，能量為35%。

2.4.1 丹酚酸A裂解規(guī)律探析 丹酚酸A在正離子模式下無響應(yīng)，在負(fù)離子模式下的多級質(zhì)譜圖見圖1。在負(fù)離子模式下，失去一個H，得到分子離子峰m/z493.114 96，然后將493在CID模式下進(jìn)行碎裂，得到碎片離子m/z359.080 23，313.073 41，295.061 34。m/z359，313，295經(jīng)高分辨率數(shù)據(jù)推導(dǎo)，分子式分別為C18H15O8(11.797)，C17H13O6(3.563)，C17H11O5(2.339)，分別由分子離子丟失C8H6O2(-11.198)，C9H8O4(10.218)，一分子丹參素得到。然后選擇m/z313進(jìn)行三級碎裂，得到碎片離子m/z203.036 24和295.062 99，將m/z203，295進(jìn)行分子式推導(dǎo)，分別為C11H7O4(6.023)和C17H11O5(5.355)，分別丟失的為C6H6O2(-9.642)和H2O。然后將m/z295進(jìn)行三級碎裂，得到了碎片離子，m/z159.045 15，109.029 45，將m/z159，109進(jìn)行分子式推導(dǎo)，分別為C10H7O2(6.501)和C6H5O2(9.943)，分別丟失的為C7H4O3(5.106)和C11H6O3(3.518)。丹酚酸A在負(fù)離子模式下的裂解圖見圖2。

注：A.MS2 493@CID35；B.MS3 493@CID35，313@CID35；C.MS3 493@CID35，295@CID35。圖1 丹酚酸A在負(fù)離子模式下的MSn圖

圖2 丹酚酸A在負(fù)離子模式下可能的裂解方式圖

2.4.2 丹酚酸B裂解規(guī)律探析 丹酚酸B屬于酚酸類物質(zhì)，在負(fù)離子模式下的多級質(zhì)譜圖見圖3。在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，在負(fù)離子模式下，失去一個H，得到分子離子峰，m/z717.841 07，將m/z717在CID模式進(jìn)行碎裂，得到碎片離子m/z519.092 42和321.040 62，將m/z519和321進(jìn)行分子式推導(dǎo)，得到C27H19O11(1.827)和C18H9O6(1.256)，分別由分子離子峰丟失一分子C9H10O5(0.645)和二分子C9H10O5(1.442)得到。將m/z519進(jìn)行三級碎裂，得到碎片離子m/z339.050 75和321.040 62，推導(dǎo)分子式為C18H11O7(0.821)和C18H9O6(1.076)，分別由m/z519丟失C9H8O4(0.821)和C9H10O5(0.821)得到；將m/z339進(jìn)行四級碎裂，得到碎片離子m/z295.060 82和277.050 69，推導(dǎo)m/z295和227分子式分別為C17H11O5(0.970)和C17H9O4(0.885)，分別丟失CO2，CO2和H2O得到。將m/z321進(jìn)行三級碎裂，得到碎片離子m/z293.044 93和279.029 45，推導(dǎo)m/z293和279分子式分別為C17H9O5(2.969)和C16H7O5(2.330)，分別丟失CO和C2H2O得到。其負(fù)離子模式下的裂解圖見圖4。

注：A.MS2 717@CID30；B.MS3 717@CID30，519@CID30；C.MS4 717@CID30，519@CID30，339@CID30；D.MS3 717@CID30，321@CID30。圖3 丹酚酸B在負(fù)離子模式下的MSn圖

圖4 丹酚酸B在負(fù)離子模式下可能的裂解方式圖

3 結(jié)論

通過使用高分辨質(zhì)譜對丹酚酸A和B可能的裂解規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A和B等酚酸類化合物在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)。丹酚酸A和B都是以丹參素為母核的化合物，因此，在質(zhì)譜裂解中，都會脫去一分子或二分子丹參素，再連續(xù)脫去CO、H2O。例如，在丹酚酸A中，分子離子m/z493脫去一分子丹參素(C9H10O5，m/z198)，得到m/z295。在丹酚酸B中，分子離子m/z717脫去一分子丹參素(C9H10O5，m/z198)得到m/z519，脫去二分子丹參素(C9H10O5，m/z198)得到m/z321。本研究對丹參中兩個化合物進(jìn)行多級碎裂分析，為其在中藥及其大復(fù)方、代謝物的分析中提供了有價值的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，LC-MS/MS技術(shù)在中藥成分鑒定方面將得到廣泛的應(yīng)用，利用MSn技術(shù)對中藥中的成分進(jìn)行裂解規(guī)律方面的分析總結(jié)，在一定程度上能夠提高對中藥成分及其代謝物檢測分析的準(zhǔn)確性。

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ESI-MS/MSAnalysisofSalvianolicAcidAandSalvianolicAcidBfromSalviamiltiorrhiza

KOUXueliang1*，YANGDonghua2，SUYingying2，LIUFeng2

(1.ShangluoCentralHospital，Shangluo726000，China；2.ShaanxiBuchangPharmaceuticalCo.Ltd.，Xianyang712000，China)

Objective：In this study，LTQ-Orbitrap high-resolution MS was used to explore the main fragmentation of salvianolic acids A and B using the CID type，which were isolated from the roots and rhizomes ofSalviamiltiorrhiza.Methods：The standard solution were injected into the MS to gain the MSndata of the two constituents，respectively，the resolution of the full scan and MSnscan was 300 00，the fragmentation type was CID，and the energy was 35%.Results：The salvianolic acids A and B were a kind of phenolic acid constituents，it had a good response under the negtive model ESI-MS.The fragmentation of salvianolic acids were mainly for the loss of danshensu group，and CO and H2O were also obvious.Conclusion：The LTQ-Orbitrap was used to reveal the fragmentation pathway of salvianolic acids A and B from which the MSnfragment ions were obtained，and it will provide a high-efficiency and sensitive method to identity the two constituents from the roots and rhizomes ofS.miltiorrhizaand its related metabolites.

Salviamiltiorrhiza；high-resolution；fragmentation.

2015-02-05)

*

寇學(xué)良，副主任藥師，研究方向：中藥新藥研發(fā)；E-mail：XL111900@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.007