李 靜，寧德魯，馬 婷，耿樹香，肖良俊，張艷麗，潘 莉

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201）

核桃（Juglans）不僅是世界著名的四大堅(jiān)果之一，還是我國(guó)重要的木本油料樹種和經(jīng)濟(jì)林樹種，具有極高的利用價(jià)值[1]。云南省作為全國(guó)核桃主產(chǎn)區(qū)，核桃栽培歷史久遠(yuǎn)，種植面積廣闊，產(chǎn)量位于全國(guó)首位[2]。多年來，人們生活水平不斷提高，對(duì)優(yōu)質(zhì)核桃品種的需求量日益增加，核桃種植面積也不斷擴(kuò)大。核桃是深根性樹種，喜溫、枝條髓心大、含水量高，抗寒性差[3-4]。春季核桃萌動(dòng)后，其抗寒能力急劇降低，因此，晚霜制約著核桃的生長(zhǎng)及發(fā)育[5-6]。由于云南氣候多樣，尤其是滇東北、滇西北等高寒山區(qū)，霜害、寒害比較嚴(yán)重，致使核桃花芽、嫩梢受凍，晚霜和倒春寒危害成為云南核桃發(fā)展的“瓶頸”，嚴(yán)重影響核桃產(chǎn)量，限制云南核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?？购詥栴}早已嚴(yán)重影響并制約著核桃的栽植及分布[7-10]。

在對(duì)低溫環(huán)境的不斷適應(yīng)中，植物依靠自身遺傳變異以及自然選擇而得到的一種適應(yīng)性的能力被稱作植物抗寒性[11]。采用人工低溫脅迫，通過改變生物膜透性以增大組織滲透液的電導(dǎo)值，進(jìn)而測(cè)定植株抗寒性的方法被稱為電導(dǎo)法[12]。

本試驗(yàn)使用電導(dǎo)法，利用人工模擬低溫，測(cè)定了鐵核桃、三臺(tái)核桃等云南省12個(gè)核桃品種1年生幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，分析核桃品種間的抗寒性差異，為云南省核桃防寒栽培、選育適合高寒山區(qū)發(fā)展的核桃品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的12個(gè)核桃品種材料為1年生嫁接苗，苗木培育地點(diǎn)為云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹木園經(jīng)濟(jì)林栽培區(qū)。品種有強(qiáng)特勒、哈特利、漾濞泡核桃、鐵核桃、維2 號(hào)、自元、三臺(tái)核桃、麗53、云新高原、云新云林、云新301 和云新306，管理水平一般，樹木長(zhǎng)勢(shì)中庸。2014年6月在各品種相對(duì)一致的部位上采集成熟無病蟲害的葉片，每一品種各5 株，所采葉片混合，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理方法 將采回的葉片用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3 次后濾紙吸干。用自封袋將各品種葉片分為5 組，置于智能低溫人工氣候箱中進(jìn)行模擬低溫處理，設(shè)置溫度梯度為21℃（CK）、5℃、0℃、-5℃、-10℃，當(dāng)人工氣候箱達(dá)到21℃，把試材置于其中，然后降低溫度，降到所需溫度時(shí)維持6 h，之后開始升高溫度，升到5℃、21℃時(shí)均要恢復(fù)1 h，降、升溫速度都為1℃/h。每次取出經(jīng)各溫度處理后的材料，馬上測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法 結(jié)合實(shí)際情況改自于孔祥生等[13]。測(cè)定時(shí)，用孔徑為0.6 cm 的打孔器在主脈兩側(cè)打孔，各試管分別放入15 片葉圓片，加入20 m l 蒸餾水，封口，在水平搖床上震蕩1 h，用DDS-307 型電導(dǎo)儀測(cè)定煮前電導(dǎo)值C1，之后把試管放在沸水中加熱20 m in，冷卻到室溫，測(cè)定電導(dǎo)值C2，同時(shí)將蒸餾水設(shè)為空白對(duì)照，測(cè)定其電導(dǎo)率C0。[(C1-C0)/(C2-C0)]×100%即為相對(duì)電導(dǎo)率，3 次重復(fù)。根據(jù)所求出的相對(duì)電導(dǎo)率，并配合Logistic 回歸方程進(jìn)行分析，所得拐點(diǎn)時(shí)溫度就是組織半致死溫度（LT50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各核桃品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化

通常情況下，植物遭受低溫破壞，細(xì)胞膜透性被不同程度損壞，電解質(zhì)不同程度外滲，以致電導(dǎo)率不同程度增加。由此可見，電解質(zhì)滲出率不僅可以反映細(xì)胞的抗性和受害程度，也可作評(píng)價(jià)植物抗寒性強(qiáng)弱的一個(gè)可靠指標(biāo)[4,14]。

隨著處理溫度的降低，供試12個(gè)核桃品種相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，如圖1。當(dāng)處理溫度從21℃下降到0℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率上升比較緩慢，0℃～-10℃時(shí)，上升較為顯著。5℃時(shí)較常溫變化最小，增幅因品種而異，最大自元為40.20%，最小三臺(tái)為2.45%，且相對(duì)電導(dǎo)率在16.41%～24.72%；0℃時(shí)，自元較常溫增長(zhǎng)幅度最大，高達(dá)79.67%；-5℃時(shí)，自元相對(duì)電導(dǎo)率最大，為48.97%，遠(yuǎn)高于其他品種（均在30%～40%），說明此時(shí)低溫對(duì)自元膜傷害的程度較其余品種大；-10℃時(shí)，漾濞泡核桃、自元、三臺(tái)的相對(duì)電導(dǎo)率均達(dá)到50%以上，而強(qiáng)特勒最小，只有38.52%，說明此時(shí)大部分品種的細(xì)胞膜損傷較重。由圖1 可以直觀地看出自元一直處在較高水平，說明其抗寒性最差。

圖1 低溫脅迫下各核桃品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化

2.2 各核桃品種葉片半致死溫度的確定

不同低溫條件下各參試品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化與Logistic 方程的變化規(guī)律一致，Logistic 回歸方程為：Y=K/(1+a ebx)。通過回歸分析確定方程的拐點(diǎn)溫度(LT50)即為核桃的半致死溫度[15-16]。該方程中，Y 為細(xì)胞傷害率，t 表示脅迫溫度，a、b、K 是方程的參數(shù)。求此方程的二階導(dǎo)數(shù)且設(shè)定其值為零，得出曲線拐點(diǎn)時(shí)t 值大小，即t=(ln a)/b，也就是半致死溫度(LT50)[17]。

供試材料的Logistic 方程、擬合度和半致死溫度如表1 所示。由表1 可知，所有參試品種的Logistic 方程擬合度R2都大于0.9，達(dá)到顯著水平。半致死溫度差異較大，最大值與最小值之間相差9.48℃，其中強(qiáng)特勒的半致死溫度達(dá)到-16.37℃，抗寒能力最強(qiáng)，麗53 的半致死溫度為-16℃，抗寒能力較強(qiáng)，僅次于強(qiáng)特勒，自元的半致死溫度只達(dá)到-6.89℃，抗寒能力最差，半致死溫度高于-10℃的除自元外，還有漾濞泡核桃和三臺(tái)，分別為-9℃和-9.47℃，抗寒性較差。根據(jù)半致死溫度，得出12個(gè)核桃品種抗寒性從強(qiáng)到弱依次為：強(qiáng)特勒＞麗53 號(hào)＞哈特利＞云新高原＞云新306＞云新云林＞云新301＞鐵核桃＞維2 號(hào)＞三臺(tái)＞漾濞泡核桃＞自元。

表1 低溫處理后各品種Logistic 方程及半致死溫度

3 結(jié)論與討論

根據(jù)1970年Lyons 和Raison 提出的低溫傷害來源于“質(zhì)膜相變”這一假說，可知細(xì)胞膜最先遭受低溫傷害，透性發(fā)生變化，以致增大了電解質(zhì)滲出率[18]。而細(xì)胞膜內(nèi)電解質(zhì)滲出率常常使用低溫傷害前后相對(duì)電導(dǎo)率表示，相對(duì)電導(dǎo)率與植物抗寒性呈顯著負(fù)相關(guān)，即電導(dǎo)率越大，植物抗寒性越差。本研究是利用人工模擬低溫條件，測(cè)定云南省12個(gè)核桃品種幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率。不同核桃品種離體葉片經(jīng)低溫處理后，變化趨勢(shì)一致，隨脅迫溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但品種不同，變化曲線各異，這與前人的研究結(jié)果一致[19-21]。

Sukumaran[22]等認(rèn)為，當(dāng)電解質(zhì)滲出率為50%，此時(shí)溫度剛好與組織的半致死溫度（LT50）相同，可以把此時(shí)溫度當(dāng)作組織的半致死溫度（LT50）。Rajeshekevar[23]指出，Logistic 曲線很好地表示了低溫對(duì)生物膜的損害過程，可以把曲線的拐點(diǎn)當(dāng)作半致死溫度(LT50)。朱根海[24]等把此方法進(jìn)一步改善，使其成為能夠消除本底影響的細(xì)胞膜傷害率，同時(shí)證明了LT50能夠無誤地表達(dá)出植物的抗寒性。前人在研究茶樹[25]、油茶[26]、葡萄[27]等植物的基礎(chǔ)上，得出LT50與植物抗寒性強(qiáng)弱呈顯著負(fù)相關(guān)，即LT50越大，植物抗寒性越差，本研究也得出相同結(jié)論。由LT50大小可得，核桃品種抗寒性大小依次為：強(qiáng)特勒＞麗53 號(hào)＞哈特利＞云新高原＞云新306＞云新云林＞云新301＞鐵核桃＞維2 號(hào)＞三臺(tái)＞漾濞泡核桃＞自元。該結(jié)果和自然降溫條件下田間觀測(cè)結(jié)果一致。電導(dǎo)法配合Logistic 方程對(duì)12個(gè)核桃品種的抗寒性鑒定結(jié)果，能夠比較準(zhǔn)確的反映出核桃抗寒性的強(qiáng)弱。

由于條件限制，本試驗(yàn)僅研究了人工低溫脅迫下云南省12個(gè)核桃品種（無性系）1年生幼苗的離體葉片，并且只是測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率和半致死溫度等較少量的指標(biāo)。除此之外，多方面的因素共同影響著核桃的抗寒性問題，且其生理過程也是極其復(fù)雜的。因此，要想進(jìn)一步研究其抗寒機(jī)能，不僅需要測(cè)定其他組織器官，還要結(jié)合室外自然低溫的變化情況，并綜合其他生理生化指標(biāo)等全面評(píng)價(jià)其抗寒性。

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