徐肖倩,張敏，王學梅，方鑫，李海玲，戴紅,*，肖瑞,#

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特010010

圍生期毒死蜱暴露致子代8周雄鼠睪丸組織的氧化損傷

徐肖倩1,張敏1，王學梅1，方鑫1，李海玲1，戴紅1,*，肖瑞1,#

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特010010

毒死蜱是目前全世界使用和銷售量最大的有機磷殺蟲劑之一。為探討圍生期毒死蜱暴露致8周雄性子鼠睪丸組織的氧化損傷，選擇健康Wistar妊娠母鼠于妊娠期(gestation days, GD)第6天至子鼠出生后(postnatal days, PND)21天通過灌胃染毒0、0.75、1.35和2.70 mg·kg-1劑量的毒死蜱，待雄性子鼠8周齡取左側(cè)睪丸實施組織病理學檢查，右側(cè)睪丸用以檢測丙二醛(maleic dialdehyde, MDA)的含量和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferases, GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)的活力。結(jié)果表明，與對照組比較，隨著染毒劑量的增加子鼠體重和睪丸、附睪臟器系數(shù)有下降的趨勢(P>0.05)；而MDA呈升高趨勢(P>0.05)。各組T-SOD和1.35、2.70 mg·kg-1劑量組GSH-Px活力的下降及2.70 mg·kg-1劑量組GST活力的升高均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。睪丸組織病理學檢查結(jié)果可見2.70 mg·kg-1劑量組睪丸組織有明顯的損傷，管腔中精液量減少，生精細胞脫落增多。上述研究結(jié)果提示母鼠于圍生期暴露于毒死蜱，可通過氧化損傷誘導(dǎo)子代雄性大鼠睪丸的毒性作用。

毒死蜱；大鼠；氧化損傷；睪丸；子代；圍生期

有機磷農(nóng)藥毒死蜱(O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，chlorpyrifos，CPF)具有廣譜、低毒和高效的特點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭生活中，是目前全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑之一，從而導(dǎo)致其在環(huán)境介質(zhì)和多種食品中廣泛殘留[1-4]，對人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成極大的潛在威脅。

有流行病學調(diào)查表明，在農(nóng)藥污染嚴重的地區(qū)男性生育力低下情況尤為突出，有機磷農(nóng)藥CPF對雄性的生殖毒性主要表現(xiàn)為引起精子質(zhì)和量的下降及睪丸組織發(fā)生退行性變化[5-6]。CPF對雄性的生殖毒性可能主要是通過誘導(dǎo)睪丸的氧化應(yīng)激和抑制睪丸標志酶的活性來影響睪丸的功能，從而影響精子的生成、發(fā)育及成熟；此外，毒死蜱對雄性激素水平也有一定的影響[7]。也有研究者認為CPF可通過形成DNA加合物而直接引起精子DNA的損傷[8]。

發(fā)育期的生理特點與CPF的理化性質(zhì)決定生命早期對CPF易感。2000年，美國環(huán)保局就提示人們：胎兒和幼子的CPF暴露危險性是成年人的10倍以上。而由于CPF不但可以通過胎盤屏障還可以通過血睪屏障，此外，在接觸者的尿液和乳汁等中都可以檢測到CPF及其代謝產(chǎn)物，這就使得嬰幼兒可以通過母體暴露于CPF[7]。截止目前，關(guān)于圍生期通過母體暴露于CPF對子鼠是否具有潛在的和長期的雄性生殖毒性作用少有報道。本文力圖通過母鼠于妊娠期(gestation days, GD)第6天至子鼠出生后(postnatal days， PND)21天(GD 6～PND21 d)灌胃染毒不同劑量的CPF，檢測子鼠至8周齡時睪丸組織的脂質(zhì)過氧化損傷及組織病理學變化，揭示圍生期通過母體暴露于CPF后對子鼠睪丸組織的潛在遠期毒性作用。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1儀器與試劑

T6新悅可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，L500臺式低速自動平衡離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，F(xiàn)SH-Ⅱ高速電動勻漿機(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)，LEICA ASP 200S全自動組織脫水機、LEICA EG1150C包埋儀(德國徠卡)，F(xiàn)INESSE 325切片機(北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)，LEICA HI1210攤片機、LEICA HI1220烘片機(上海徠卡儀器有限公司)，BM 2000倒置熒光顯微鏡(寧波市江東璟瑞儀器儀表有限公司)。

CPF(純度為97%)購自太原瑞和平科貿(mào)有限公司，MDA、GST、GSH-Px、T-SOD及總蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純。

1.2實驗動物的分組及染毒

Wistar大鼠及飼料購自內(nèi)蒙古大學實驗動物中心，符合國家二級動物標準，合格證號：<京動字>第8806R0ll號。雌性50只，雄性21只，自然光照，給予充足的食物和水。

Wistar大鼠10周齡時進行交配，通過陰道涂片查精子法確定妊娠。將妊娠雌鼠隨機分為4組，每組9只。于GD 6～PND21 d灌胃染毒以下劑量的CPF：0(灌胃等量玉米油)、0.75、1.35和2.70 mg·kg-1，灌胃容量為3 mL·kg-1，每周連續(xù)染毒6 d。子鼠PND21 d后不再給予任何處理，雌雄子鼠分籠飼養(yǎng)，直至子鼠8周時每組隨機選擇8只雄性子鼠進行實驗。

1.3實驗方法

1.3.1一般狀況觀察

每天觀察實驗大鼠的飲水、進食等情況及有無中毒癥狀出現(xiàn)。

1.3.2體重及睪丸、附睪臟器系數(shù)的測定

于染毒期末稱量大鼠體重，處死大鼠后迅速分離睪丸和附睪并計算臟器系數(shù)，公式如下：

臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/體重(g)×100%

1.3.3脂質(zhì)過氧化指標測定

10%睪丸組織勻漿的制備：處死實驗動物后迅速分離出睪丸組織，并剔除周圍的脂肪后稱重。取右側(cè)睪丸組織以1:9的比例加入生理鹽水，在冰水浴中制備組織勻漿，再以3 000 r·min-1離心10 min后取上清。

MDA含量及GST、GSH-Px和T-SOD的活力及總蛋白的測定，均按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4睪丸組織病理學檢查

實驗大鼠左側(cè)睪丸經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色并于光學顯微鏡下觀察。

石蠟包埋：體積分數(shù)為70%的乙醇，1 h→體積分數(shù)為90%的乙醇，1.5 h→體積分數(shù)為95%的乙醇Ⅰ，1 h→體積分數(shù)為95%的乙醇Ⅱ，1 h→100%乙醇Ⅰ，40 min→100%乙醇Ⅱ，1 h→100%乙醇Ⅲ，1 h→二甲苯Ⅰ，1 h→二甲苯Ⅱ，1 h→石蠟Ⅰ，58 ℃，1 h→石蠟Ⅱ，58 ℃，1 h→石蠟Ⅲ，58 ℃，1 h。

HE染色：二甲苯Ⅰ，10 min→二甲苯Ⅱ，10 min→無水乙醇Ⅰ，3 min→無水乙醇Ⅱ，2 min→體積分數(shù)為95%的乙醇，3 min→體積分數(shù)為80%的乙醇，3 min→自來水洗，2 min→蘇木精染液，3 min→蒸餾水洗，1 min→體積分數(shù)為1%的鹽酸乙醇分化，10 s→自來返蘭，2 min→體積分數(shù)為1%的伊紅染液，5 s→體積分數(shù)為80%的乙醇，5 s→體積分數(shù)為95%的乙醇，5 s→無水乙醇Ⅰ，2 min→無水乙醇Ⅱ，2 min→二甲苯Ⅰ，2 min→二甲苯Ⅱ，2 min→中性樹膠封片。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果(Result)

2.1CPF對雄鼠體重和睪丸、附睪臟器系數(shù)的影響

各組動物染毒期間活動正常、反應(yīng)靈敏、被毛光滑整潔，未見明顯中毒癥狀。母鼠于圍生期染毒CPF后對8周雄性子鼠體重和睪丸、附睪臟器系數(shù)的影響如表1所示。隨著CPF染毒劑量的增加，子鼠體重(ANOVA：F=0.338，P=0.798)、睪丸臟器系數(shù)(ANOVA：F=1.591，P=0.214)和附睪臟器系數(shù)(ANOVA：F=2.007，P=0.126)呈現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

2.2CPF對雄鼠睪丸組織氧化損傷指標的影響

2.2.1CPF對雄鼠睪丸組織MDA含量的影響

母鼠于GD 6～PND21 d暴露于CPF，對8周雄性子鼠睪丸組織MDA含量的影響無統(tǒng)計學意義(ANOVA：F=1.321，P=0.287)，但隨CPF染毒劑量的增加MDA含量有升高的趨勢(如圖1)。

圖1　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸MDA的影響(n=8)Fig. 1　The influence of perinatal CPF exposure on testicular MDA level of 8 week offspring male rat (n=8)

2.2.2CPF對雄鼠睪丸組織GST活性的影響

母鼠圍生期CPF暴露引起8周雄性子鼠睪丸GST酶活性的升高(ANOVA：F=6.563，P=0.002)，但僅2.70 mg·kg-1劑量組酶活性的升高有統(tǒng)計學意義，并且各劑量組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。如表2所示。

表1　圍生期毒死蜱(CPF)暴露對8周雄性子鼠體重和睪丸、附睪臟器系數(shù)的影響(x± s，n=8)

Table 1　The body weight, organ coefficient of testis and epididymis of 8 week offspring male rat after

perinatal exposure to chlorpyrifos (CPF) (x±s，n=8)

表1　圍生期毒死蜱(CPF)暴露對8周雄性子鼠體重和睪丸、附睪臟器系數(shù)的影響(x± s，n=8)

組別Group體重/gBodyweight/g睪丸臟器系數(shù)/%Testicularorgancoefficient/%附睪臟器系數(shù)/%Epididymalorgancoefficient/%對照組Controlgroup235.600±10.2000.911±0.0580.187±0.008毒死蜱組CPFdosedgroup0.75mg·kg-1234.200±9.8000.870±0.0540.186±0.0301.35mg·kg-1231.900±8.9000.863±0.0650.174±0.0142.70mg·kg-1230.600±14.2000.860±0.0260.169±0.006

2.2.3CPF對雄鼠睪丸組織GSH-Px活性的影響

由表3可知，妊娠母鼠于GD 6～PND21 d暴露于CPF后，導(dǎo)致8周雄性子鼠睪丸組織GSH-Px活性的下降(ANOVA：F=351.363，P=0.000)，1.35和2.70 mg·kg-1劑量組與對照組及0.75 mg·kg-1劑量組比，酶活性的下降有統(tǒng)計學意義。其余各組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2.4CPF對雄鼠睪丸組織T-SOD活性的影響

母鼠圍生期暴露于CPF后引起8周子鼠睪丸T-SOD活性的下降(ANOVA：F=6.162，P=0.002)。與對照組比較，CPF各劑量組酶活性的下降均有統(tǒng)計學意義(見表4)；但各劑量組間酶活性的變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3CPF對8周子鼠睪丸組織形態(tài)學的影響

睪丸生精小管各級生精細胞由外到內(nèi)依次為精

表2　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸GST活性

的影響(x± s，n=8)

Table 2　The effect of perinatal CPF exposure on testicular

GST activity of 8 week offspring male rat (x± s，n=8)

表2　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸GST活性

組別GroupGST/(U·mg-1prot)T值TvalueP值Pvalue對照組Controlgroup28.797±6.248——毒死蜱組CPFdosedgroup0.75mg·kg-137.804±7.4012.3210.1671.35mg·kg-138.227±10.3752.4300.1312.70mg·kg-145.993±6.2944.4300.001

注：T值,與對照組比較的統(tǒng)計量值；P值,與對照組比較的P值。

Note:Tvalue, the statistical value compared with control group; P value, compared with the control group.

原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。圍生期CPF暴露后，8周子鼠睪丸組織病理切片顯示，與對照組比較，2.70 mg·kg-1劑量組生精小管直徑變小，各級生精細胞減少，管腔可見脫落的生精細胞，并且精液量有所下降。1.35 mg·kg-1劑量組腔內(nèi)精子量減少，可見脫落的生精細胞；而0.75 mg·kg-1劑量組睪丸組織病理學變化不明顯。如圖2所示。

3　討論(Discussion)

氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用是大多數(shù)組織細胞損傷的共同機制。在生理情況下，生物體內(nèi)的氧自由基處于不斷產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡狀態(tài)。如果機體氧自由基的產(chǎn)生增多和/或清除能力下降，便會出現(xiàn)氧化應(yīng)激。研究表明，有機磷農(nóng)藥能加劇機體的脂質(zhì)過氧化作用[9-10]；CPF也可擾亂機體的氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化損傷[11]。本研究通過妊娠母鼠染毒CPF，檢測對8周子鼠睪丸的抗氧化酶活力、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和睪丸組織病理學的影響，探討圍生期暴露于CPF后，對子代雄性生殖系統(tǒng)的潛在遠期毒性

表4　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸T-SOD

活性的影響(x±s，n=8)

Table 4　The effect of perinatal CPF exposure on testicular

T-SOD activity of 8 week offspring male rat (x± s，n=8)

表4　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸T-SOD

組別GroupT-SOD/(U·mg-1prot)T值TvalueP值Pvalue對照組Controlgroup134.596±11.448——毒死蜱組CPFdosedgroup0.75mg·kg-198.742±10.2452.9420.0391.35mg·kg-190.584±19.3853.6110.0072.70mg·kg-188.767±42.0103.7600.005

注：T值，與對照組比較的統(tǒng)計量值；P值，與對照組比較的P值。Note:T value, the statistical value compared with control group; P value, compared with the control group.

表3　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸GSH-Px活性的影響(x± s，n=8)

注：T值，與對照組及0.75 mg·kg-1組比較的統(tǒng)計量值；P值，與對照組及0.75 mg·kg-1組比較的P值。Note:T value, the statistical value compared with control group and 0.75 mg·kg-1group; P value, compared with the control group and 0.75 mg·kg-1group.

圖2　圍生期CPF暴露對8周雄性子鼠睪丸組織病理學的影響(HE 40×10) 注：a為精原細胞，b為脫落的精子細胞，c為精子。Fig. 2　The effect of perinatal CPF exposure on testicular histopathological of 8 week offspring male rat (HE 40×10)Note: a, spermatogonia； b, exfoliated sperm cell； c, sperm.

作用及其機制。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物之一，具有強交聯(lián)性，能與含游離氨基的蛋白質(zhì)和核酸等交聯(lián)，以干擾核酸、蛋白質(zhì)和細胞的功能[12]；其含量的多少可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，CPF劑量組MDA含量升高，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明圍生期暴露于CPF可導(dǎo)致8周子鼠睪丸組織的自由基增多，從而引起氧化損傷；但可能由于CPF的染毒劑量較低，并且是經(jīng)母體染毒，所以MDA水平的變化不明顯。

SOD和GSH-Px是機體廣泛存在的抗氧化酶，SOD能清除超氧陰離子自由基，GSH-Px促進機體過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物的分解。而GST具有消除體內(nèi)自由基和解毒的雙重功能。雄性生精細胞膜上也存在多種抗氧化酶，并呈高水平表達[13]，這些抗氧化酶可保證各級生精細胞在精子發(fā)生過程中的存活時間,消除細胞突變的潛在性[14],對生精細胞的分化與發(fā)育起著重要的抗氧化作用。如適量的SOD具有維持精子正常形態(tài)、活力和功能的作用[15]；GSH-Px對精子的成熟、保持精子的完整性和受精能力方面具有重要作用[16]，有研究報道，9 mg·kg-1的CPF可引起雄性大鼠睪丸組織脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation, LPO)水平增加1.79倍，SOD、GSH-Px和GST的活性分別下降27.75%、29.13%和11.52%[17]。本研究中與對照組比較，1.35、2.70 mg·kg-1劑量組睪丸GSH-Px和各劑量組睪丸T-SOD酶活性的下降均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而僅2.70 mg·kg-1劑量組睪丸GST酶活性的升高有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨染毒時間延長，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基和過氧化物不斷積累，反過來可能影響SOD和GSH-Px活力，GSH-Px的巰基部位受到自由基的攻擊，可能引起酶活性的下降。而GST是污染物在體內(nèi)代謝相Ⅱ的重要酶之一，有研究表明，急性有機磷農(nóng)藥口服中毒患者血漿中GST酶活性有所升高[18]。本研究中GST的升高可能是由機體對CPF進行解毒過程的反饋調(diào)節(jié)引起的，其具體機制要有待于進一步研究。

本次研究顯示CPF對體重影響不明顯，與Suresh Joshi等[19]的報道一致。而以往關(guān)于CPF對雄性生殖器官臟器系數(shù)影響的研究尚未得出一致結(jié)論。劉相鑫[20]以2.7、5.4和12.8 mg·kg-1劑量的CPF對雄性大鼠連續(xù)染毒90 d，結(jié)果睪丸臟器系數(shù)的變化不明顯， 而文一等[21]以7.35 mg·kg-1劑量CPF灌胃染毒8周后，雄性大鼠的睪丸臟器系數(shù)顯著增加。在體重未變的情況下睪丸重量減輕，提示可能是睪丸內(nèi)生殖細胞減少所致[22]。以往研究提示，CPF對實驗動物體重和生殖器官臟器系數(shù)的影響可能與染毒途徑、時間、劑量等有關(guān)。由此可以認為，本研究的染毒劑量水平不引起包括體重增長抑制、臟器系數(shù)改變等毒理學效應(yīng)終點的變化。CPF可引起睪丸生精小管發(fā)生退行性變化、間質(zhì)變寬、各級生精細胞減少及生精細胞脫落[23-24]。本研究中2.70 mg·kg-1CPF劑量組睪丸病理學檢查表現(xiàn)出明顯的生精細胞脫落增多，管腔中精液量減少。

WHO認為在21世紀影響人類生活和健康的主要疾病中，不孕不育癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病[25]。而環(huán)境污染是導(dǎo)致男性不育最主要的原因[26]，我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥是我國最大的有害環(huán)境因素之一。研究提示，有機磷農(nóng)藥對男性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)有毒性作用，不僅引起精子質(zhì)量下降，還可損傷精子的遺傳物質(zhì)[27-28]。CPF也具有一定的雄性生殖毒性，并且可能對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生潛在的遠期毒性作用，甚至是終身的。因此有機磷農(nóng)藥CPF的雄性生殖毒性更應(yīng)引起人們的重視。

通訊作者簡介：戴紅(1958-)，女，生態(tài)學博士，教授，主要研究方向環(huán)境衛(wèi)生學與毒理學。

肖瑞(1979-)，女，博士研究生，教授，主要研究方向雄性不育機制。

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Perinatal Exposure to Chlorpyrifos Induced Testicular Oxidative Damage in 8 Week Offspring Male Rat

Xu Xiaoqian1, Zhang Min1,Wang Xuemei1, Fang Xin1, Li Hailing1, Dai Hong1,*, Xiao Rui1,#

Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010010, China

23 June 2015accepted 31 August 2015

Chlorpyrifos is one of the largest used and saled organophosphorus pesticides throughout the world. To explore the testicular oxidative damage of 8 week offspring male rat induced by perinatal exposure to chlorpyrifos, the healthy pregnant Wistar female rats were exposed to chlorpyrifos of 0, 0.75, 1.35 and 2.70 mg·kg-1by gavage during GD 6—PND21 d. Until the offspring male rat reached the age of 8 week, histopathological changes of left testis were observed. We also detected the level of MDA and the activity of GST, GSH-Px, and T-SOD in right testis. The results showed that although no statistical significance were observed in body weight, the organ coefficient of testis and epididymis compared with control group, both of them showed a downward trend and of MDA showed an upward trend when the dose increased (P>0.05). The decrease in the activity of T-SOD of all dose groups, the increase of the activity of GSH-Px of 1.35 mg·kg-1and 2.70 mg·kg-1dose groups and the increase in activity of GST of 2.70 mg·kg-1dose group were statistically significant (P<0.05). The histopathological examination indicated that the testis of 2.70 mg·kg-1dose group had significant damage. It is found that the semen volume was reduced and exfoliated spermatogenic cell was increased. Chlorpyrifos impaired the balance of antioxidant system, thus induced lipid peroxidation damage to the testis of 8 week rat by maternal exposure during GD 6—PND21 d. It is proposed that chlorpyrifos had potential and long-term toxic effect to male reproductive system by perinatal exposure.

chlorpyrifos; rat; oxidative damage; testis; offspring; perinatal exposure

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學博士課題啟動基金(ykd12bq01)

徐肖倩(1986-)，女，碩士，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail: xxq20100@163.com；

Corresponding author)， E-mail: bennidai@aliyun.com；

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail: 1426954814@qq.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150623002

2015-06-23 錄用日期：2015-08-31

1673-5897(2015)6-159-07

X171.5

A

徐肖倩, 張敏, 王學梅, 等. 圍生期毒死蜱暴露致子代8周雄鼠睪丸組織的氧化損傷[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(6): 159-165

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