陶賢繼，黎翠蘭，劉冬雨，魏華，何義亮，呂為群

1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳與育種中心，上海 201306 2. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699 3. 上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240

食物源nC60損害斑馬魚腦、鰓、腎和肝胰腺正常機能

陶賢繼1，黎翠蘭1，劉冬雨1，魏華2,，何義亮3，呂為群1

1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳與育種中心，上海 201306 2. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201699 3. 上海交通大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240

水體中穩(wěn)定存在的富勒烯納米晶體(nC60)可被浮游動物濾食，并通過食物鏈傳遞到更高營養(yǎng)級生物。為探究食物源nC60的生物效應(yīng)，本試驗選取攜帶nC60的大型溞喂養(yǎng)斑馬魚21 d，考察了食物源nC60對斑馬魚腦、鰓、腎和肝胰腺4個器官中ROS、Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性等指標，用以評價食物源nC60對斑馬魚的機能影響。暴露于食物源nC60下的結(jié)果表明：斑馬魚腦ROS隨時間增加而增加，暴露21 d后增加了79.17%。鰓、腎Na+K+-ATPase活性隨暴露時間增加而降低，暴露21 d后分別降低了47.09%和51.07%；鰓、腎Ca2+-ATPase活性隨暴露時間增加而減少，暴露21 d后分別降低了28.28%和35.13%。鰓、腎、肝胰腺AKP活性隨時間增加而增加，暴露21 d后分別增加45.97%、26.68%和83.01%；鰓、腎、肝胰腺ACP活性隨時間增加而增加，暴露21 d后分別增加38.85%、84.12%和55.77%。肝胰腺GPT和GOT活性隨時間增加而降低，暴露21 d后各降低了50.05%和76.50%。本研究不但闡述了食物源nC60降低高一級水生動物(斑馬魚)腦、鰓、腎和肝胰腺的正常機能，而且為進一步研究食物源nC60對水生生物的生態(tài)毒理提供了部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

富勒烯；納米水穩(wěn)型C60；大型溞；斑馬魚

由于具有碳原子構(gòu)成的“足球”結(jié)構(gòu)，富勒烯(C60)形成了特殊的碳π鍵和“籠”狀結(jié)構(gòu)，可以進行加成、衍生和包埋，因此被廣泛應(yīng)用于防曬霜、藥物傳遞載體和有機磁體等產(chǎn)品[1]。隨著大規(guī)模的生產(chǎn)與應(yīng)用，C60通過廢棄和泄露等方式進入周圍環(huán)境，最終隨著降雨等進入水中。歐洲城市污水處理廠的排放水中已檢測出含有C60[2]。C60在水體中可通過多種途徑形成水穩(wěn)型納米晶體C60(nC60)[3]。目前已知nC60阻礙斑馬魚胚胎的發(fā)育并導(dǎo)致胚胎畸形水腫[4]；提高斑馬魚體內(nèi)的氧化性，并抑制生長[5]。此前諸多報道均將斑馬魚直接暴露于nC60懸浮液中以評價毒性效應(yīng)和機制，而通過食物源nC60暴露產(chǎn)生的風(fēng)險尚未多見[6]。

雖然已有關(guān)于金屬/金屬氧化物TiO2、Se、ZnO、Au納米顆粒通過食物鏈方式暴露造成風(fēng)險的評價[6-7]，但是對于有機納米顆粒nC60的研究甚少[8]。雖然Fraser等[8]利用飼料中添加nC60暴露給虹鱒幼魚，但是利用天然水體初級消費者從水體中富集的nC60，并以此作為餌料喂養(yǎng)斑馬魚的評價尚未見報道。斑馬魚(Danio rerio)和大型溞(Daphnia magna)是2種評估環(huán)境毒性和風(fēng)險的模式生物，本研究利用它們之間的“捕食”和“被捕食”的關(guān)系，評價食物源nC60(大型溞攜帶)給斑馬魚造成的影響。將斑馬魚暴露于食物源nC60(大型溞攜帶)，構(gòu)成了“大型溞和斑馬魚”兩者間簡單食物鏈節(jié)，有助于更好地探索可能存在的生態(tài)食物鏈風(fēng)險。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1化學(xué)試劑

C60購于美國Materials Electronics Research Corporation，純度≥99%。四氫呋喃和甲苯(99.9%)為液相色譜純，購自Fisher Scientific公司。測試ROS、ACP和AKP、ATPase、GOT和GPT的試劑盒購于南京建成生物工程研究所。其他相關(guān)試劑為分析純或者優(yōu)級純，購于上海國藥集團。

1.2試驗生物

大型溞(Daphnia magna)購于美國Carolina Biological Supply Company，按U.S. EPA標準方法[9]進行養(yǎng)殖。具體養(yǎng)殖條件如下：12 h:12 h晝夜周期，(20 ± 1) ℃，6.5 mg·L-1以上溶氧，3 000 Lx光強。每日8:00、16:00喂食斜生柵藻(水生4號培養(yǎng)基[10]培養(yǎng))，維持藻細胞密度為(1±0.2)×105藻細胞·mL-1。

斑馬魚(Danio rerio)購于上海藍天水族館，體重為(0.211±0.001) g，體長為(23.45±0.01) mm。每1尾斑馬魚單獨飼養(yǎng)于1個80 mL玻璃瓶，含水50 mL。養(yǎng)殖用水提前曝氣24 h，每天更換1/4。維持12 h:12 h晝夜周期，(28 ± 0.5) ℃，6.5 mg·L-1以上溶氧。用大型溞馴養(yǎng)2周，馴養(yǎng)期間內(nèi)成活率 > 97%。

1.3nC60制備

nC60的制備參照Tao等[11]方法進行。具體操作如下：稱取100 mg C60溶于4 L四氫呋喃(THF)中，沖氮氣(99.99%)去除頂部氧氣，密封、避光后攪拌24 h。使用分液漏斗將250 mL純水加入等量攪拌的飽和C60THF溶液中，持續(xù)攪拌1 min。為除去THF和THF衍生物，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Büchi Rotovap system)蒸餾去250 mL體積，然后補加250 mL超純水，重復(fù)蒸餾3次。冷卻12 h形成穩(wěn)定平衡的懸浮液，用0.22 μm的醋酸纖維膜過濾后備用。為了進一步去除THF及其衍生物，連續(xù)使用旋轉(zhuǎn)超濾杯、氮氣加壓過濾nC60溶液10次(每次更換一半體積溶劑)。最后使用GC-MS未檢測到THF及其衍生物的存在。使用透射電鏡觀察制備的nC60(JEM 2100F) (見圖1)。

圖1　nC60的透射電鏡圖Fig. 1　Transmission electron microscope image of nC60

1.4大型溞體內(nèi)nC60的生物累積及食物源nC60的制備

試驗首先將大型溞暴露于最高無效應(yīng)濃度(0.1 mg·L-1)的nC60溶液中[10]，用以確定大型溞體內(nèi)nC60生物累積達到平衡的時間和最大累積量。挑選160只健康的5日齡幼溞(未懷卵)，用中等硬度水沖洗3次，之后暫養(yǎng)4 h以除去腸道中的殘渣。然后暴露于100 mL的0.10 mg·L-1nC60溶液中，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h各取20只，用純水沖洗3次(每次5 min)，用于測定大型溞體內(nèi)nC60的累積量。試驗確定0.1 mg·L-1溶液中累積平衡時間為4 h。將5日齡大型溞浸泡于0.1 mg·L-1nC60溶液中4 h之后，用純水沖洗3次(每次5 min)，冷凍干燥8 h(冷凍干燥機，Labconco)，密封存于-40 ℃冰箱中備用。

利用實驗室原有方法測定水溶液和大型溞體內(nèi)C60的含量[12]。水中C60的含量測定如下：取2 mL濾液于10 mL棕色小瓶中，加入1 mL 0.1 mol·L-1Mg(ClO4)2和2 mL甲苯，并充分混合，在恒溫震蕩儀(室溫，300 r·min-1)中振蕩萃取8 h，于4 ℃中靜置30 min，-20 ℃下冷凍，取上層甲苯相，測定345 nm波長的吸光度值，根據(jù)標準曲線(y =31.593x，x為OD345，y為nC60濃度(mg·L-1)，R2= 0.9988)計算溶液中C60濃度。大型溞體中C60的含量測定如下：取20只暴露于nC60溶液(0.1 mg·L-1)4 h的大型溞，用中等硬度水沖洗體表3次(去除體表nC60)。之后吸干體表水分，加入2 mL超純水，手動勻漿15 min，轉(zhuǎn)入10 mL棕色小瓶中，然后重復(fù)水體中C60測定步驟。

1.5食物源nC60對斑馬魚的毒性效應(yīng)試驗

將攜帶nC60的大型溞喂養(yǎng)斑馬魚，用以評價食物源nC60對斑馬魚的毒性效應(yīng)。為保證采樣數(shù)量(8次×4尾·次-1)，64尾斑馬魚隨機平均分配到含nC60組和無nC60組2個組，每組32尾(試驗養(yǎng)殖條件與馴養(yǎng)條件相同)。據(jù)斑馬魚對大型溞攝食預(yù)試驗，每條斑馬魚每日投喂16只大型溞(分4次，日投飼率為4%)，每次喂食后2 h去除斑馬魚的糞便。分別投喂有/無nC60的大型溞作為食物。試驗為期21 d。第0、3、6、9、12、15、18和21天分別對2個試驗組隨機采樣4尾斑馬魚，取腦組織、鰓、腎和肝胰腺于生理鹽水(冰浴)中漂洗干凈，然后用濾紙吸干后存放于液氮罐(不超過1周)。為了較為全面的評價食物源nC60對腦細胞膜抗氧化、鰓和腎的離子調(diào)節(jié)及相關(guān)能量提供，以及肝胰腺解毒功能和能量提供3個方面機能的影響，故此試驗將檢測斑馬魚腦活性氧自由基(ROS)，測定鰓、腎中Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性，分析肝胰腺AKP、ACP、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性，以評價食物源nC60對鰓、肝、腎和肝胰腺產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

1.6斑馬魚腦、鰓、腎、肝胰腺組織前處理

取腦組織于生理鹽水(冰浴)中漂洗解凍，用濾紙吸干并稱重。以1:20的質(zhì)量比(w/w)加入4 ℃勻漿介質(zhì)(100 mmol·L-1磷酸緩沖液(PBS)、pH 7.4)，冰浴下手動勻漿，于3 070 r·min-冷凍離心10 min (4 ℃)。取上清液13 000 r·min-1再次冷凍離心20 min(4 ℃)，然后用100 mmol·L-1的PBS重懸沉淀(300 μL、pH 7.4)，混勻后待測。

鰓、腎、肝胰腺組織于生理鹽水(冰浴)中漂洗解凍，用濾紙吸干并稱重。以1∶9的質(zhì)量比(w/w)加4 ℃生理鹽水，手動勻漿后冷凍離心(4 ℃、2 500 r·min-1、10 min)。取上清液，分別用生理鹽水稀釋成2%鰓、腎和1%的肝胰腺組織勻漿液，待測。

1.7斑馬魚腦、鰓、腎、肝胰腺組織各參數(shù)的測定

ROS的測定參考Shao等[13]的方法，利用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)在細胞內(nèi)脂解后被活性氧氧化產(chǎn)生強綠色熒光的原理測定。具體操作如下：取100 μL的試樣加100 μL的4 μmol·L-1的DCFH-DA，孵育30 min(37 ℃)。使用熒光酶標儀(Biotek, Synergy H4)測定熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長522 nm)。結(jié)果以熒光強度(fluorescence intensity)/毫克蛋白表示(FI·mg pr.-1)。

Na+K+-ATPase活性參照Leone等[14]的方法測定。Ca2+-ATPase活性參考Jiang等[15]的方法測定。ATP酶活力單位定義為：每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。即微摩爾分子磷·毫克蛋白-1·小時-1(μmol Pi·mg pr.-1·h-1)。

酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)的活性參考Tao等[16]的方法測定。AKP或ACP酶活力單位定義為：37 ℃，每克組織蛋白與基質(zhì)作用15 min或30 min產(chǎn)生1 mg酚定義為AKP或ACP的1個活力單位。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的參照周順伍等[17]的方法進行測定。GPT和GOT單位定義為：37 ℃，每克組織蛋白與基質(zhì)作用1 min使吸光度每下降0.001為1個活力單位。

腦、鰓、腎和肝胰腺組織蛋白含量采用考馬斯亮藍Bradford法測定，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準偏差(means±SD)表示；使用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)計算、繪圖和線性回歸；采用SPSS 19.0進行方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05(P < 0.05)，極顯著差異為0.01(P < 0.01)。

2　結(jié)果 (Results)

2.1大型溞體內(nèi)nC60的累積

相比于空白組，大型溞體內(nèi)nC60的含量隨時間的延長不斷增加，至4 h逐漸趨于平衡(圖2)。根據(jù)實驗室已發(fā)表的研究[12]生物累積方程，計算得知此時大型溞nC60的累積量為37.91 mg·kg-1濕重。由于大型溞是一種喂養(yǎng)斑馬魚的優(yōu)質(zhì)天然餌料，故此研究選取了累積有nC60的大型溞作為斑馬魚餌料，用以評價食物源nC60沿食物鏈傳遞的風(fēng)險。

圖2　大型溞體內(nèi)nC60的累積Fig. 2　The nC60 accumulation in D. magna

圖3　食物源nC60提高斑馬魚腦組織ROS的含量Fig. 3　The dietary nC60 in D. magna increased the ROS content in the zebrafish brain tissues

2.2食物源nC60促進斑馬魚腦組織ROS產(chǎn)生

相比于空白組，斑馬魚腦組織ROS含量隨食物源nC60暴露時間的延長不斷增加，至21 d時達到最大值(圖3)。從第0天至第6天，nC60緩慢提升腦組織中ROS含量，至第9天出現(xiàn)顯著性增強(P < 0.05)，并于21 d達到最大值(263 ± 1.68) FI·mg pr.-1。第9、12、15、18和21天分別比第0天增加了37.61%、53.80%、66.59%、75.66%和79.17%。

圖4　食物源nC60降低斑馬魚鰓Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性Fig. 4　The dietary nC60 decreased the activities of Na+K+-ATPase and Ca2+-ATPase in zebrafish gill tissues

圖5　食物源nC60增強鰓AKP和ACP活性Fig. 5　The dietary nC60 increased the activities of AKP and ACP in zebrafish gill tissues

2.3食物源nC60對斑馬魚鰓Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase和AKP、ACP活性的影響

2.3.1食物源nC60降低斑馬魚鰓Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性

相比于空白組，鰓Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性隨食物源nC60暴露時間的延長不斷降低，并在21 d降至最低值(圖4)。食物源nC60組鰓Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性呈逐漸降低趨勢，至12 d出現(xiàn)極顯著性下降(P < 0.01)，最終于21 d達到最小值(2.12 ± 0.10)和(2.21 ± 0.08) μmol Pi·mg Pr-1·h-1。第12、15、18和21天，鰓Na+K+-ATPase活性分別比第0天降低了15.12%、22.55%、36.45%和47.09%；鰓Ca2+-ATPase活性分別比第0天降低了11.06%、11.19%、19.64%和28.28%。

2.3.2食物源nC60增加斑馬魚鰓AKP和ACP活性

相比于空白組，鰓AKP和ACP活性隨食物源nC60暴露時間的延長增加，在21 d增至最大值(圖5)。食物源nC60組鰓AKP和ACP活性呈上升趨勢，至9 d有顯著性升高(P < 0.05)，最終于21 d達到最大值(23.11 ± 0.79)和(36.64 ± 1.12) U·g Pr.-1。第9、12、15、18和21天，鰓AKP活性分別比第0天增加了15.15%、23.50%、29.70%、39.56%和45.97%；鰓ACP活性分別比第0天增加了23.83%、28.21%、28.82%、36.10%和38.85%。

2.4食物源nC60對斑馬魚腎Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、AKP和ACP活性影響

2.4.1食物源nC60降低斑馬魚腎Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性

相比于空白組，腎Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性隨食物源nC60暴露時間的延長不斷降低，并在21 d降至最低值(圖6)。食物源nC60組腎Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性呈下降趨勢，至9 d有顯著性降低(P < 0.01)，于21 d分別達到最小值(0.74 ± 0.04)和(0.27 ± 0.03) Pi·mg pr-1·h-1。第9、12、15、18和21天，Na+K+-ATPase活性分別比第0天降低了13.95%、16.40%、20.44%、48.38%和51.07%；Ca2+-ATPase活性分別比第0天降低了10.04%、15.81%、16.82%、28.65%和35.13%。

2.4.2食物源nC60增加斑馬魚腎AKP和ACP的活性

相比于空白組，腎AKP和ACP活性隨食物源nC60暴露時間的延長迅速增加，并在21 d增至最大值(圖7)。食物源nC60組腎AKP和ACP活性呈上升趨勢，至9 d有顯著性升高(P < 0.05)，于21 d達到最大值(17.33 ± 0.51)和(11.53 ± 0.54) U·g pr.-1。第9、12、15、18和21天，腎AKP活性分別比第0天增加了7.83%、13.57%、14.90%、22.53%和26.68%；ACP活性分別比第0天增加了35.34%、39.30%、59.45%、80.35%和84.12%。

圖6　食物源nC60降低斑馬魚腎Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性Fig. 6　The dietary nC60 decreased the activities of Na+K+-ATPase and Ca2+-ATPase in zebrafish kidney tissues

圖7　食物源nC60增強腎AKP和ACP活性Fig. 7　The dietary nC60 increased the activities of AKP and ACP in zebrafish kidney tissues

圖8　食物源nC60增強斑馬魚肝胰腺AKP和ACP活性Fig. 8　The dietary nC60 increased the activities of AKP and ACP in hepatopancreas tissues

2.5食物源nC60對斑馬魚肝胰腺AKP、ACP、GPT和GOT活性的影響

2.5.1食物源nC60增加斑馬魚肝胰腺AKP和ACP的活性

相比于空白組，肝胰腺AKP和ACP活性隨食物源nC60暴露時間的延長迅速增加，并在21 d時增至最大值(圖8)。食物源nC60組肝胰腺AKP和ACP活性呈上升趨勢，至9 d有顯著性升高(P < 0.05)，于21 d達到最大值(24.18 ± 0.43)和(22.96 ± 1.07) U·g pr.-1。第9、12、15、18和21天，肝胰腺AKP活性分別比第0天增加了46.95%、57.11%、59.04%、68.14%和83.01%；肝胰腺ACP活性分別比第0天增加了17.74%、25.52%、33.72%、41.88%和50.05%。

圖9　食物源nC60降低斑馬魚肝胰腺GPT和GOT活性Fig. 9　The dietary nC60 decreased the activities of GPT and GOT in zebrafish hepatopancreas tissues

2.5.2食物源nC60降低斑馬魚肝胰腺GPT和GOT的活性

相比于空白組，肝胰腺GPT和GOT活性隨食物源nC60暴露時間的延長降低，并在21 d降至最小值(圖9)。食物源nC60組肝胰腺GPT和GOT活性有下降趨勢，至第9天有顯著性降低(P < 0.01)，于21 d達到最低值(17.29 ± 2.96)和(10.41 ± 1.41) U·g pr.-1。第9、12、15、18和21天，肝胰腺GPT分別比第0天增加了17.74%、25.52%、33.72%、41.88%和50.05%；肝胰腺GOT活性分別比第0天增加了35.38%、41.19%、51.12%、71.08%和76.50%。

3　討論(Discussion)

3.1食物源nC60氧化脅迫斑馬魚腦細胞膜

活性氧(ROS)自由基包括超氧自由基、過氧化氫、過氧化物和羥基自由基等，是呼吸鏈的副產(chǎn)物，當(dāng)線粒體發(fā)生“電子漏”即氧與酶復(fù)合物直接結(jié)合，機體將產(chǎn)生ROS[18]。由于C60特有的籠狀結(jié)構(gòu)，可使生物體產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)，提高生物體ROS含量[19]。Zhu等[19]、Oberd?rster等[20]和朱小山等[21]各自通過體外直接暴露途徑試驗，都發(fā)現(xiàn)nC60可使斑馬魚腦產(chǎn)生過量ROS，出現(xiàn)氧化性損傷?？梢妌C60在體外直接暴露條件下可致使腦部產(chǎn)生過量ROS。本試驗采用大型溞攜帶的nC60喂養(yǎng)斑馬魚，結(jié)果顯示nC60可致使斑馬魚腦產(chǎn)生過量ROS。由此可見，nC60不論通過體外暴露途徑，還是通過食物源暴露途徑都使斑馬魚腦ROS含量升高。過量的ROS可以導(dǎo)致細胞凋亡，異常誘發(fā)防御基因表達，異常動用離子通道等。這些由于過量的ROS造成的魚腦組織的毒性效應(yīng)，將導(dǎo)致腦細胞像體外培養(yǎng)的細胞一樣損壞[22]，這些腦細胞的損傷將極大的導(dǎo)致腦功能的紊亂。故食物源nC60和體外直接暴露nC60都可通過產(chǎn)生過量ROS損害腦組織正常功能。其他納米顆粒，如納米銀和納米TiO2也可以誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生過量ROS[23-24]，故評價納米顆粒物生物風(fēng)險不能忽視納米顆粒對腦部ROS的誘導(dǎo)產(chǎn)生現(xiàn)象。

3.2食物源nC60抑制斑馬魚腎和鰓Na+、K+、Ca2+離子的調(diào)節(jié)能力

Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase，是普遍存在于細胞膜上的跨膜載體蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Na+、K+和Ca2+濃度，在維持細胞的滲透壓、保持細胞的靜息電位方面、肌肉收縮和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起到主要作用[25]，特別是在鰓和腎作為調(diào)節(jié)體內(nèi)離子水平的重要器官。鰓上氯細胞中存在大量的Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase和離子轉(zhuǎn)運蛋白[26]，是調(diào)控離子水平的主要功能區(qū)域這些離子通道；同時腎在維持水鹽平衡和調(diào)節(jié)滲透壓方面有很重要的作用，并為大多數(shù)電解液重吸收和轉(zhuǎn)運提供能量[25]。當(dāng)通道酶活性的降低時，其機體功能會部分喪失。Hou等[27]采用體外暴露表明nC60抑制Na+K+-ATPase活性，從而抑制魚體對Na+和K+等離子調(diào)節(jié)能力。已有研究表明nC60可從小腸吸收進入鰓、腎等器官[28]。本試驗從食物暴露途徑進一步研究表明，nC60隨時間延長而不斷降低斑馬魚鰓、腎Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase的活性。因此，nC60無論是直接暴露還是食物源方式暴露都可以降低魚的離子調(diào)節(jié)能力。也有其他研究表明，nCu、nTiO2也產(chǎn)生抑制離子轉(zhuǎn)運和離子濃度調(diào)節(jié)能力[26, 29]。因此，納米顆粒在直接暴露和食物途徑暴露時都可能存在降低魚鰓離子調(diào)節(jié)能力的風(fēng)險。食物源nC60降低鰓、腎Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的原因可能是nC60可從小腸吸收進入鰓、腎等器官[28]，進而干擾膜蛋白的功能和氧化損傷膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生泄漏[22]，致使跨膜載體蛋白如Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase受膜電位影響降低活性，最終降低細胞對Na+、K+、Ca2+離子調(diào)節(jié)能力。綜合上述，食物源nC60影響Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性，從而影響生物體離子代謝。將來研究尚需進一步確認nC60對Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性影響的機制。

3.3食物源nC60降低斑馬魚腎、肝胰腺的同化能量利用

AKP和ACP都是水生生物體內(nèi)極其重要的調(diào)控酶和水解酶，催化磷酸單脂水解和磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，破壞清除掉表面帶有磷酸酯的異物，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運轉(zhuǎn)過程起著重要作用[16]。AKP和ACP活性升高有利于斑馬魚相應(yīng)組織的物質(zhì)代謝，增加提供ADP磷酸化形成ATP所需的無機磷，增強機體在防御過程中的能量供應(yīng)。此試驗結(jié)果表明，食物源nC60提高腎、肝胰腺的AKP和ACP的活性。其他納米材料，如Nano-Zn和Nano-Cu，使得血清中AKP和ACP的活性顯著升高[30-31]。由此可見，nC60和其他納米顆粒增強血清和肝細胞等部位AKP和ACP的活性，增強細胞用于防御消耗的能量，減少細胞用于物質(zhì)存儲、生長和分裂的能量，降低同化作用的總能量。nC60提高AKP和ACP的活性，其原因可能是受到食物源nC60的脅迫誘導(dǎo)時，為克服nC60進入或防止中毒，機體會迅速做出防御反應(yīng)，誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生更多的AKP和ACP[32]，提供更多的能量用于防御。由于腎和肝胰腺是nC60等主要代謝器官[33]，需要對nC60進行轉(zhuǎn)運和解毒，從而增加細胞用于此類活動的能量消耗。這些器官細胞為了平衡代謝外物(nC60)所消耗的大量能量，極大提高AKP和ACP活性[34]。將來內(nèi)容需著重于nC60對AKP和ACP活性調(diào)控途徑和作用機制研究。

3.4食物源nC60損害斑馬魚肝胰腺解毒能力

肝臟是水生動物的重要的解毒和代謝器官，主要依靠轉(zhuǎn)氨酶的作用去除(分解)異物蛋白(解毒)。GOT和GPT是肝臟細胞中重要氨基轉(zhuǎn)移酶，它們在蛋白質(zhì)代謝中起著重要的轉(zhuǎn)移氨基作用[35]，可以將異物蛋白進行轉(zhuǎn)氨基作用去除。轉(zhuǎn)氨酶活性越大，氨基酸轉(zhuǎn)換作用越強，即轉(zhuǎn)氨酶活性大小反映了氨基酸氧化代謝強度的大小。有研究表明老鼠口服納米銀后，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)淋巴滲透的炎癥，使得細胞受損，釋放出GOT和GPT進入血液[36]。Nano-ZnO也損害肝組織，使細胞膜通透性增加，使GOT和GPT從肝細胞逸出進入血液，提高血清中轉(zhuǎn)氨酶水平[37]。本試驗中斑馬魚喂食了大型溞攜帶的nC60，結(jié)果顯示nC60抑制了肝胰臟GOT和GPT活性，即抑制了肝細胞的轉(zhuǎn)氨基作用，降低了肝細胞除去外來蛋白的能力。由此可見，食物源nC60或其他納米顆粒都可能會損害魚和其他動物肝細胞，增加膜通透性，抑制氨基酸代謝能力，從而損害斑馬魚解毒能力。

總之，食物源nC60脅迫斑馬魚腦細胞產(chǎn)生過量ROS，抑制鰓、腎組織Na+、K+-ATPase和Ca2+-ATPase的調(diào)節(jié)能力，降低鰓、腎和肝胰腺ACP、AKP活性，減弱肝胰腺組織中GPT和GOT活性。今后的研究亟需探討有機納米C60顆粒在魚體的蓄積量和分布等機體遷移行為。

通訊作者簡介：魏華(1962-)，男，博士，教授，研究方向為魚類生理學(xué)。

[1]Langa F, Nierengarten J. Fullerenes: Principles and Applications [M]. UK London Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2011: 1-198

[2]Gottschalk F, Sonderer T, Scholz R, et al. Modeled environmental concentrations of engineered nanomaterials (TiO2, ZnO, Ag, CNT, fullerenes) for different regions [J]. Environmental Science & Technology, 2009, 43(24): 9216-9222

[3]Andrievsky G V, Kosevich M V, Vovk O M, et al. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes [J]. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1995, 12: 1281-1282

[4]Usenko C Y. In vivo evaluation of carbon fullerene toxicity using embryonic zebrafish [J]. Carbon, 2007, 45(9): 1891-1898

[5]Zhu X, Zhu L, Li Y, et al. Developmental toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos after exposure to manufactured nanomaterials: Buckminster fullerene aggregates (nC60) and fullerol [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, 26(5): 976-979

[6]Skjolding L M, Winther-Nielsen M, Baun A, et al. Trophic trasfer of differently functionalized zinc oxide nanoparticles from crustaceans (Daphnia magna) to zebrafish (Danio rerio) [J]. Aquatic Toxicology, 2014, 157: 101-108

[7]Lee W M, Yoon S J , Shin Y J, et al. Trophic transfer of gold nanoparticles from Euglena gracilis or Chlamydomonas reinhardtii to Daphnia magna [J]. Environmental Pollution, 2015, 201: 10-16

[8]Fraser T W. Dietary toxicity of single-walled carbon nanotubes and fullerenes (C60) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J]. Nanotoxicology, 2011, 5(1): 98-108

[9]EPA. Standard Operating Procedure for Mass Culture (Daphnia pulex) [S]. SoBran， Cincinnati： EPA, 2004

[10]余言想, 魏華, 陶賢繼, 等. 納米水穩(wěn)型C60(nC60)促進Zn2+和Cr6 +在大型溞體內(nèi)的吸收、抗氧化性和急性毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(3): 569-577

Yu Y X, Wei H, Tao X J, et al. Aqueous stable fullerene nanocrystals nC60promoted the accumulation, anti - oxidation and acute toxicity of Zn2+and Cr6+on Daphnia magna [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(3): 569-577 (in Chinese)

[11]Tao X, Yu Y, Fortner J D, et al. Effects of aqueous stable fullerene nanocrystal (nC60) on Scenedesmus obliquus: Evaluation of the sub-lethal photosynthetic responses and inhibition mechanism [J]. Chemosphere, 2015, 122: 162-167

[12]Tao X, He Y, Zhang B, et al. Effects of stable aqueous fullerene nanocrystal (nC60) on Daphnia magna: Evaluation of hop frequency and accumulations under different conditions [J]. Journal of Environmental Science, 2011, 23(2): 322-329

[13]Shao B. DNA damage and oxidative stress induced by endosulfan exposure in zebrafish (Danio rerio) [J]. Ecotoxicology, 2012, 21(5): 1533-1540

[14]Leone F A, Garcon D P, Lucena M N, et al. Gill-specific (Na+, K+)-ATPase activity and α-subunit mRNA expression during low-salinity acclimation of the ornate blue crab Callinectes ornatus (Decapoda, Brachyura) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2015, 186: 59-67

[15]Jiang L, Bechtel M D, Bean J L, et al. Effects of gangliosides on the activity of the plasma membrane Ca2+-ATPase [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2014, 1838(5): 1255-1265

[16]Tao X, Wang C, Wei H, et al. Effects of dietary cholesterol levels on moulting performance, lipid accumulation, ecdysteroid concentration and immune enzymes activities of juvenile Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J]. Aquaculture Nutrition, 2014, 20: 467-476

[17]周順伍, 鄒思湘, 姜涌明. 動物生物化學(xué)(第三版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 1-360

[18]Buonocore G, Perrone S, Tataranno M. Oxygen toxicity: Chemistry and biology of reactive oxygen species [J]. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine, 2010, 15(4): 186-190

[19]Zhu S, Oberd?rster E M H. Toxicity of an engineered nanoparticle (fullerene, C60) in two aquatic species, daphnia and fathead minnow [J]. Marine Environmental Research, 2006, 62(4): S5-S9

[20]Oberd?rster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass [J]. Environmental Health Perspectives, 2004, 112(10): 1058-1062

[21]朱小山, 朱琳, 郎宇鵬, 等. 人工納米材料富勒烯(C60)低劑量長期暴露對鯽魚的氧化傷害[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(4): 855-861

Zhu X S, Zhu L, Lang Y P, et al. Oxidative damages of long-term exposure to low level fullerenes (C60) in Carassius auratus [J]. Environmental Science, 2008, 29(4): 855-861 (in Chinese)

[22]Sayes C M, Gobin A M, Ausman K D, et al. Nano-C60cytotoxicity is due to lipid peroxidation [J]. Biomaterials, 2005, 26(36): 7587-7595

[23]Rahman M F, Wang J, Patterson T A. Expression of genes related to oxidative stress in the mouse brain after exposure to silver-25 nanoparticles [J]. Toxicology Letters, 2009, 187(1): 15-21

[24]Long T C, Veronesi B. Nanosize titanium dioxide stimulates reactive oxygen species in brain microglia and damages neurons in vitro [J]. Environmental Health Perspectives, 2007, 115(11): 1631-1637

[25]魏華, 吳垠. 魚類生理學(xué)(第2版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 10-340

[26]Griffitt R. Exposure to copper nanoparticles causes gill injury and acute lethality in Zebrafish (Danio rerio) [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(23): 8178-8186

[27]Hou W C, Westerhoff P, Posner J D. Biological accumulation of engineered nanomaterials: A review of current knowledge [J]. Environmental Science: Processes & Impacts, 2012, 1(1): 103-122

[28]Hillyer J, Albrecht R. Gastrointestinal persorption and tissue distribution of differently sized colloidal gold nanoparticles [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2001, 90(12): 1927-1936

[29]Ramsden C S, Smith T J, Shaw B J, et al. Dietary exposure to titanium dioxide nanoparticles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): No effect on growth, but subtle biochemical disturbances in the brain [J]. Ecotoxicology, 2009, 18(7): 939-951

[31]Chen Z, Meng H, Xing G, et al. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo [J]. Toxicology Letter, 2006, 163(2): 109-120

[32]譚樹華, 袁志棟, 劉雨芳, 等. 鎘對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2012, 23(9): 2595-2601

Tan S H, Yuan Z D, Liu Y F, et al. Effects of Cd2+on antioxidant system in hepatopancreas of Procambarus clarkia [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(9): 2595-2601 (in Chinese)

[33]Yamago S, Tokuyama H, Nakamura E, et al. In vivo biological behavior of a water-miscible fullerene:14C labeling, absorption, distribution, excretion and acute toxicity [J]. Chemistry & Biology, 1995, 2(6): 385-389

[34]鄭永華, 蒲富永. 汞對鯉鯽魚組織轉(zhuǎn)氨酶活性的影響 [J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1997, 19(1): 41-45

Zheng Y H, Pu F Y. Effect of mercury on transaminase activities of tissues in carpio & cauratus [J]. Journal of Southwest Agricultural University, 1997, 19(1): 41-45 (in Chinese)

[35]惠天朝, 施明華, 朱蔭湄. 硒對羅非魚慢性鎘中毒肝抗氧化酶及轉(zhuǎn)氨酶的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2000, 20(3): 264-266

Hui T C, Shi M H, Zhu Y M. Effects of selenium on antioxidant enzymes and transaminases of liver in cadmium chronic toxic Tilapia nilotica [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2000, 20(3): 264-226 (in Chinese)

[36]Cha K, Hong H, Choi Y, et al. Comparison of acute responses of mice livers to short-term exposure to nano-sized or micro-sized liver particles [J]. Biotechnology Letter, 2008, 30(11): 1893-1899

[37]Amutha C, Subramanian P. Tissues damaging effect of zinc oxide nanoparticles on Oreochromis mossambicus [J]. Biochemical and Cellular Archives, 2009, 9(2): 235-239

◆

The Dietary Uptake of Nanocrystals (nC60) Decreases the Functions of Gill, Kidney and Hepatopancreas of Zebrafish (Daniorerio)

Tao Xianji1, Li Cuilan1, Liu Dongyu1, Wei Hua2,*, He Yiliang3, Lu Weiqun1

1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai 201306, China 2. Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201699, China 3. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

27 April 2015accepted 15 June 2015

Aqueous stable fullerene nanocrystals (nC60) can be filtered by zooplanktons, and sequentially transferred to upper trophic level organisms. To investigate the dietary biological effects of nC60, Daphnia magna with cumulated nC60were fed to zebrafish for 21 d. The reactive oxygen species (ROS), Na+-K+-ATPase, Ca2+-ATPase, alkali phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP), glutamic-pyruvic transaminase (GPT), and glutamic-oxalacetic transaminase (GOP) were measured in the brain, gills, kidney, and hepatopancreas to investigate the dietary effects on zebrafish organs. The dietary exposure results indicated that dietary nC60increased the ROS production in brain tissues with increasing experimental time, and finally increased by 79.17%. The Na+-K+-ATPase activities in the gills and kidney tissues decreased with increasing experimental time, and finally decreased by 47.09% and 51.07%, respectively. The Ca2+-ATPase activities in the gills and kidney tissues decreased with increasing experimental time, and finally decreased by 28.28% and 35.13%, respectively. The AKP activities in the gills, kidney and hepatopancreas tissues were increased with increasing experimental time, and finally increased by 45.97%, 26.68% and 83.01%, respectively. The ACP activities were increased with increasing experimental time, and finally increased by 38.85%, 84.12%, and 55.77%, respectively. The GPT and GOT activities in the hepatopancreas were decreased with the increasing experimental time, and finally decreased by 50.05% and 76.50%, respectively. In summary, this study not only describes the decreased functions of the brain, gill, kidney and hepatopancreas as a result of dietary nC60in upper trophic level organisms (zebrafish), but also provides fundamental data regarding the dietary effects of nC60on aqueous organisms for the further eco-toxicological study.

fullerene (C60); aqueous stable fullerene nanocrystals (nC60); Daphnia magna; Danio rerio

國家自然科學(xué)基金(41272381)；國家海洋局公益項目(201505034); 上海市知識服務(wù)平臺上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物遺傳與育種中心(ZF1206)

陶賢繼(1975-)，男，博士，研究方向為水生動物生理學(xué)，E-mail: xjtao@shou.edu.cn

Corresponding author)， E-mail: weih@shafc.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150427001

2015-04-27 錄用日期：2015-06-15

1673-5897(2015)6-181-10

X171.5

A

陶賢繼, 黎翠蘭, 劉冬雨, 等. 食物源nC60損害斑馬魚腦、鰓、腎和肝胰腺正常機能[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(6): 181-190

Tao X J, Li C L, Liu D Y, et al. The dietary uptake of nanocrystals (nC60) decreases the functions of gill, kidney and hepatopancreas of zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 181-190 (in Chinese)