王志剛，趙曉松，徐偉慧，蘇云鵬，由義敏，劉帥，胡影，胡云龍，張穎

1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161006 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030

黑土微生物量和酶活性對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯污染的響應(yīng)

王志剛1，趙曉松1，徐偉慧1，蘇云鵬1，由義敏1，劉帥1，胡影1，胡云龍1，張穎2,*

1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161006 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030

鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)是一種在環(huán)境中廣泛存在的有毒有機(jī)化合物，已被我國(guó)列為優(yōu)先控制污染物之一。本研究探討了不同濃度的DBP污染對(duì)黑土呼吸、微生物量以及黑土酶活性的影響。結(jié)果表明，DBP污染處理的黑土呼吸速率和微生物量碳較對(duì)照均顯著增加；微生物氮在DBP污染過(guò)程中呈“降低-升高-降低”波動(dòng)性變化；微生物磷與DBP污染濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；DBP對(duì)黑土多酚氧化酶表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，對(duì)轉(zhuǎn)化酶和蛋白酶活性表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制；在DBP污染過(guò)程中脲酶呈現(xiàn)被激活狀態(tài)；黑土過(guò)氧化氫酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在著高度的相關(guān)性。由此可推斷，DBP污染改變了黑土呼吸、微生物量和酶學(xué)活性的代謝特征，進(jìn)而有可能影響了黑土的生態(tài)系統(tǒng)功能，威脅到黑土的可持續(xù)利用。

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)；土壤呼吸；微生物量；土壤酶；黑土；污染

鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)是一類人工合成的有機(jī)化合物[1]，主要用于塑料產(chǎn)品的成型劑。目前，PAEs已經(jīng)成為全球最為普遍的工業(yè)化合有機(jī)污染物之一，其中鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate, DBP)在土壤、地表水、沉積物、淡水生物、植物和蔬菜中被廣泛檢出[2]，也因其具有潛在的環(huán)境危害[3-4]，中國(guó)環(huán)境檢測(cè)中心和美國(guó)環(huán)境保護(hù)局已經(jīng)將DBP列為優(yōu)先控制污染物[5]。

東北黑土是世界上僅有的三大黑土區(qū)之一，在保障我國(guó)糧食安全方面具有不可替代的作用[6]。DBP可以通過(guò)塑料薄膜、灌溉和農(nóng)藥等方式進(jìn)入土壤環(huán)境[7]，在東北黑土中DBP含量在2.8～14.6 mg·kg-1[8]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)美國(guó)環(huán)境保護(hù)局制定的0.08 mg·kg-1土壤凈化標(biāo)準(zhǔn)[9]，但是其在黑土中的行為特征及其規(guī)律尚不明確，因此，研究DBP污染對(duì)黑土微生物生物量和酶活性的影響，對(duì)于闡釋DBP的環(huán)境行為和黑土資源保護(hù)具有重要意義。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)土壤制備

本試驗(yàn)始于2014年9月30日，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站(哈爾濱市)的溫室中進(jìn)行。供試土壤取自哈爾濱香坊農(nóng)場(chǎng)(45°41′N, 126°45′E)的大豆田，為表層土壤(0～20 cm)，在土壤中未檢測(cè)到DBP殘留。土壤被充分混均后，過(guò)2 mm篩，去除植物殘?bào)w和石塊。土壤基本性質(zhì)如表1所示。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

DBP(純度>99.9%)購(gòu)于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息中心，助溶劑為丙酮，制備成1 000 mg·L-1的DBP儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

每個(gè)樣品稱取650 g土壤置于1 L(12.2 cm × 12 cm)花盆中，調(diào)整實(shí)驗(yàn)土壤濕度到田間最大持水量的80%，在25 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)7 d后，用DBP儲(chǔ)備液調(diào)整土壤DBP濃度，共計(jì)5個(gè)處理，分別為對(duì)照(CK)，0 mg·kg-1；DBP1處理，5 mg·kg-1；DBP2處理，10 mg·kg-1；DBP3處理，20 mg·kg-1；DBP4處理，40 mg·kg-1。對(duì)照處理(CK)添加等量丙酮進(jìn)行處理。每個(gè)處理5次重復(fù)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)期間，用恒重法保持土壤含水量30%，溫度為(25±2) ℃，培養(yǎng)箱內(nèi)相對(duì)濕度為70%±5%。于不同時(shí)間取樣測(cè)定土壤中的微生物學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3土壤微生物呼吸速率與生物量的測(cè)定

土壤微生物呼吸速率采用堿液吸收滴定法測(cè)定，用每小時(shí)呼出的CO2量表示(mg (CO2)·kg-1·h-1)[10]。土壤微生物量碳采用氯仿熏蒸0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，重鉻酸鉀氧化法測(cè)定；微生物量氮采用氯仿熏蒸0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，茚三酮比色法測(cè)定；微生物量磷采用氯仿熏蒸NaHCO3提取，鉬銻抗比色法測(cè)定[11-12]。

表1　試驗(yàn)黑土的基本性質(zhì)

注：USDA代表美國(guó)農(nóng)業(yè)部。

Note: USDA stands for U.S. Department of Agriculture; TOC stands for total organic carbon; CEC stands for cation exchange capacity; TN stands for total nitrogen; TP stands for total phosphorus.

1.4土壤酶活性的測(cè)定

脲酶活性測(cè)定用苯酚-次氯酸鈉比色法，以37 ℃、24 h后，1 g土壤生成的NH3-N質(zhì)量(μg)表征，表示為μg·g-1·h-1(以NH3-N計(jì))；土壤過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定采用KMnO4滴定法，結(jié)果以20 min后1 g土壤消耗0.05 mol·L-1KMnO4的毫升數(shù)來(lái)表示；多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法；土壤轉(zhuǎn)化酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定；蛋白酶活性測(cè)定用酪蛋白酸鈉分析方法，以50 ℃、2 h后，5 g土壤生成的酪氨酸質(zhì)量(μg)表征，表示為μg·g-1·h-1(以酪氨酸計(jì))；酸性磷酸酶活性以24小時(shí)每克土壤中釋放出酚的毫克數(shù)表征[13-14]。為了消除土壤和試劑的誤差，每一土樣均設(shè)無(wú)基質(zhì)和無(wú)土壤對(duì)照，3次重復(fù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Sigma Plot 12.5作圖。

2　結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1黑土微生物呼吸速率對(duì)DBP污染的響應(yīng)

土壤呼吸是衡量土壤微生物活性或評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)，通過(guò)圖1可知，DBP污染處理10 d內(nèi)，4個(gè)污染濃度處理的黑土呼吸速率均顯著(P<0.05)高于對(duì)照(CK)，在處理7 d后增幅逐漸減少，且在10 d內(nèi)各濃度處理間的呼吸速率呈現(xiàn)顯著差異。

2.2黑土微生物量對(duì)DBP污染的響應(yīng)

黑土微生物碳、氮和磷在DBP污染過(guò)程中呈現(xiàn)了不同的變化規(guī)律(圖2)。微生物碳在DBP污染5 d后，與對(duì)照相比，表現(xiàn)為低濃度(5和10 mg·kg-1)促進(jìn)，高濃度(20和40 mg·kg-1)抑制；10 d后各個(gè)濃度處理均表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，但是低濃度DBP處理強(qiáng)于高濃度的促進(jìn)效應(yīng)，20 d后促進(jìn)效應(yīng)逐漸減弱(圖2a)。微生物氮在DBP污染過(guò)程中呈“降低-升高-降低”波動(dòng)性變化(圖2b)，在5 d時(shí)，微生物氮與DBP污染濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=0.75**)，處理10 d后各處理均呈現(xiàn)相似的波動(dòng)變化，但是并未發(fā)現(xiàn)與DBP污染濃度之間的相關(guān)性。微生物磷受到DBP污染的抑制(圖2c)，且微生物磷與DBP污染濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=0.63**)，在15 d后這種抑制效應(yīng)有逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)。

圖1　黑土微生物呼吸速率對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染的響應(yīng)Fig. 1　Response of black soil respiratory rate to di-n-butyl phthalate (DBP) contamination

圖2　黑土微生物量對(duì)DBP污染的響應(yīng)Fig. 2　Response of microbial biomass in black soil to DBP contamination

2.3黑土酶活性對(duì)DBP污染的響應(yīng)

黑土酶活性在DBP污染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見(jiàn)圖3。在處理5 d時(shí)，DBP對(duì)黑土多酚氧化酶有促進(jìn)作用，且低濃度(5和10 mg·kg-1)處理的促進(jìn)效應(yīng)顯著強(qiáng)于高濃度(20和40 mg·kg-1)處理，10 d后呈現(xiàn)為抑制效應(yīng)，且有隨著污染濃度提升而增強(qiáng)的趨勢(shì)(圖3a)。轉(zhuǎn)化酶活性在低濃度DBP(5和10 mg·kg-1)條件下表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，而高濃度DBP(20和40 mg·kg-1)條件下表現(xiàn)為先抑制后促進(jìn)(圖3b)。在DBP污染過(guò)程中脲酶呈現(xiàn)激活效應(yīng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加激活效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，但在15 d后激活效應(yīng)有減弱的趨勢(shì)，且激活效應(yīng)與DBP濃度正相關(guān)(r2=0.78)(圖3c)；黑土過(guò)氧化氫酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制(P<0.05)，且抑制程度與DBP處理濃度均呈顯著相關(guān)(r2=0.85和r2=0.79)(圖3d, e)。在處理25 d內(nèi)，低濃度DBP(5、10和20 mg·kg-1)處理對(duì)黑土蛋白酶有促進(jìn)作用，且差異極其顯著(P<0.01)，而高濃度DBP(40 mg·kg-1)處理中，黑土蛋白酶活性顯著高于對(duì)照(P<0.01)(圖3f)。

2.4土壤微生物量與酶活性的相關(guān)性分析

將黑土培養(yǎng)25 d時(shí)的生物量(碳、氮、磷)、土壤酶活性和DBP起始濃度進(jìn)行Pearson雙尾相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。微生物碳含量與蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與轉(zhuǎn)化酶活性呈顯著正相關(guān)；微生物氮與酸性磷酸酶活性呈顯著正相關(guān)；過(guò)氧化氫酶與微生物磷和酸性磷酸酶活性呈顯著正相關(guān)，與脲酶和蛋白酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；DBP污染濃度與脲酶活性呈顯著正相關(guān)，與酸性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在相關(guān)性，有著緊密聯(lián)系。

圖3　黑土酶活性對(duì)DBP污染的響應(yīng)Fig. 3　Effects of DBP contamination on enzyme activities in black soil

3　討論(Discussion)

微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中參與一切有機(jī)物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，且對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的變化極為敏感，可以反映土壤質(zhì)量的變化和人類活動(dòng)的干擾[15]。土壤呼吸速率可作為土壤生物活性和土壤肥力乃至透氣性的指標(biāo)，并且指示著土壤生態(tài)系統(tǒng)演替的過(guò)程與方向[16]。

本研究結(jié)果表明，DBP污染導(dǎo)致土壤基礎(chǔ)呼吸被激活，且激活作用隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，這一結(jié)果與郭楊等(2010)[17]在水稻土中和高軍等(2008)[18]在黃棕壤中的研究結(jié)果相一致。原因可能是PAEs可作為某些土壤微生物的碳源和能源，利用這些底物時(shí)表現(xiàn)出較高的代謝活性，土壤呼吸速率升高；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其生物有效性降低，土壤呼吸下降。鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)對(duì)黑土呼吸具有低濃度促進(jìn)高濃度抑制的效應(yīng)[16]，與DBP對(duì)黑土呼吸的影響不一致，可能是因?yàn)榉肿恿?DMP和DBP分子量分別為194.19和278.34)和水分配系數(shù)(DMP和DBP的lgKow分別為1.60和3.74)不同所引起的[19]。土壤微生物量是土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動(dòng)力，可作為土壤中有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫(kù)[20]。本研究結(jié)果表明，DBP污染顯著增加黑土微生物碳含量，這一現(xiàn)象與王鑫宏[21]在吉林軟土上的研究結(jié)果相似，也與微生物呼吸速率增加的結(jié)果相互印證；微生物氮呈現(xiàn)波動(dòng)降低的現(xiàn)象以及微生物磷受到DBP污染的顯著抑制，說(shuō)明DBP污染導(dǎo)致了黑土養(yǎng)分庫(kù)的改變，這可能是酞酸酯污染導(dǎo)致了黑土微生物的功能代謝菌群的改變所致[22]。污染物進(jìn)入到土壤中會(huì)引起土壤中各微生物種群活細(xì)胞數(shù)量及組成結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致土壤中的微生物在生理代謝方面做出響應(yīng)[23]，最終影響到土壤酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在DBP污染過(guò)程中，脲酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶和多酚氧化酶的活力均不同程度的受到了影響，與張建等 (2010)[24]和Gao等(2010)[25]在其他類型土壤上的研究結(jié)果不盡一致，這可能與土壤類型的不同有關(guān)系。過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶和轉(zhuǎn)換酶活性可以反映出土壤有機(jī)碳素的轉(zhuǎn)化速率，蛋白酶和脲酶可以反映土壤中有效氮素的代謝水平，磷酸酶可以反應(yīng)土壤磷素代謝轉(zhuǎn)化速率[26-27]。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物量、土壤酶活性和DBP污染濃度三者之間存在相關(guān)性，且脲酶、酸性磷酸酶和過(guò)氧化氫酶與DBP污染相關(guān)性更強(qiáng)，這一結(jié)果與Eivazi等[28]和Frankenberger等[29]的研究結(jié)果相一致。因此，我們可以推斷DBP污染影響了黑土中碳氮磷元素的轉(zhuǎn)化循環(huán)，從而有可能影響黑土生態(tài)系統(tǒng)功能。

表2　DBP污染過(guò)程中土壤微生物量與土壤酶活性的相關(guān)性分析

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

Note:*P<0.05, ** P<0.01.

本研究發(fā)現(xiàn)黑土微生物呼吸速率受DBP污染的促進(jìn)；DBP污染顯著增加黑土微生物碳含量，微生物氮呈現(xiàn)波動(dòng)降低，微生物磷受到顯著抑制；DBP對(duì)黑土多酚氧化酶表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制；DBP對(duì)過(guò)氧化氫酶和蛋白酶活性表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制；在DBP污染過(guò)程中脲酶呈現(xiàn)激活效應(yīng)；黑土轉(zhuǎn)化酶和酸性磷酸酶均受到DBP污染的顯著抑制。且土壤微生物量、土壤酶活性與DBP污染濃度之間存在相關(guān)性，有著緊密聯(lián)系。因此，DBP污染改變了黑土呼吸、微生物量和酶學(xué)活性的代謝特征，進(jìn)而有可能影響了黑土的生態(tài)系統(tǒng)功能，威脅到黑土的可持續(xù)利用。

致謝：Kui Chen教授在論文寫(xiě)作過(guò)程中給予了指導(dǎo)與幫助，在此謹(jǐn)表謝忱！

通訊作者簡(jiǎn)介：張穎(1972—)，女，環(huán)境科學(xué)與工程博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文近200篇。

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Response of Microbial Biomass and Enzyme Activities in Black Soil to Di-n-butyl Phthalate Contamination

Wang Zhigang1, Zhao Xiaosong1, Xu Weihui1, Su Yunpeng1, You Yimin1, Liu Shuai1, Hu Ying1, Hu Yunlong1, Zhang Ying2,*

1. Institute of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China 2. Institute of Resource and Environment, Northeast Agriculture University, Harbin 150001, China

20 August 2015accepted 26 October 2015

Di-n-butyl phthalate (DBP), one of the phthalate esters, is ubiquitous environmental pollutant, and it is listed as an environmental priority pollutant by China State Environmental Protection Administration. The purpose of this study is to estimate the impact of DBP contamination on respiration, microbial biomass and enzyme activity in black soil. The results showed that the microbial respiratory rate and the content of the microbial biomass C in the black soil were promoted by the DBP contamination. The content of the microbial biomass N fluctuated greatly under the DBP contamination. The content of the microbial biomass P was correlated negatively with the DBP concentration. Further, the activity of polyphenol oxidase was promoted after the inhibition occurred at the beginning. The activities of protease and invertase were promoted by the low DBP concentration, but inhibited by the high DBP concentration. The activity of urease was activated by DBP in the black soil. The activities of catalase and acid phosphatase was significantly inhibited by the DBP contamination in the black soil. The correlation analysis showed the correlation among the soil microbial biomass, the soil enzyme activity and the DBP concentration. According to the results, DBP could be the key factor that alters the metabolism of the microorganisms in the black soil, and impacts the ecosystem functions in the black soil.

di-n-butyl phthalate (DBP); soil respiration; microbial biomass; soil enzyme; black soil; contamination

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA101405)；黑龍江省青年科學(xué)基金(QC2013C032)

王志剛(1980-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)，E-mail: wzg1980830@sina.com

Corresponding author)， E-mail: zhangying@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150820001

2015-08-20 錄用日期：2015-10-26

1673-5897(2015)6-199-08

X171.5

A

王志剛，趙曉松，徐偉慧, 等. 黑土微生物量和酶活性對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯污染的響應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(6): 199-205

Wang Z G, Zhao X S, Xu W H, et al. Response of microbial biomass and enzyme activities in black soil to di-n-butyl phthalate contamination [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 199-205 (in Chinese)