王敬琦，孔維文，劉婷婷，陳南，楊柏云，何曉青

北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

基于esp基因和JCV標(biāo)記的MST方法在五大流域典型水源地中的應(yīng)用

王敬琦，孔維文，劉婷婷，陳南，楊柏云，何曉青

北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

非點(diǎn)源污染目前已經(jīng)成為影響水體環(huán)境的重要污染。微生物源示蹤技術(shù)(microbial source tracking, MST)是解決非點(diǎn)源污染的一項(xiàng)新技術(shù)，它可以確定污染的宿主來源。腸球菌esp基因和多瘤病毒JCV可以作為檢測水體中人源糞便污染的分子標(biāo)記，其靈敏度和特異性都很高。為分析五大流域水源地是否受到人源糞便的污染，對遼河、海河、淮河、長江和黃河五大流域典型水源地水樣進(jìn)行采集和檢測，選取人源糞便特異病原微生物腸球菌的esp基因和多瘤病毒JCV建立了相應(yīng)的MST分子檢測方法。結(jié)果表明，五大流域的典型水源地采樣點(diǎn)均有可能受到了人源糞便的污染，可為當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)部門提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。

腸球菌esp基因；多瘤病毒JCV；水源地；MST

非點(diǎn)源污染是指溶解的或固體污染物(地面的各種污染物質(zhì)如城市垃圾、農(nóng)村家畜糞便，農(nóng)田中的化肥、農(nóng)藥、重金屬及其他有毒或有機(jī)物)，從非特定的地點(diǎn)隨著暴雨產(chǎn)生的地面徑流，進(jìn)入受納水體造成的污染[1-3]。與點(diǎn)源污染相比，非點(diǎn)源污染起源于分散、多樣的地區(qū)，地理邊界和發(fā)生位置難以識別和確定，隨機(jī)性強(qiáng)、成因復(fù)雜潛伏周期長，因而防治十分困難，目前已成為非常重要的影響水體環(huán)境質(zhì)量的污染源。只有準(zhǔn)確的定位污染源，才能制定有效的治理方案解決污染危機(jī)。

傳統(tǒng)的糞便污染監(jiān)測方法僅能通過微生物的數(shù)量反映水體受糞便污染的程度，卻不能識別其真正來源[4]。為了解決這一問題，1980年后，以美國為代表的國家開始了對微生物源追蹤技術(shù)的研究。美國弗吉尼亞大學(xué)的環(huán)境學(xué)家Hagedorn和Wiggins提出微生物源示蹤技術(shù)(microbial source tracking, MST)技術(shù)。MST是一種利用微生物在環(huán)境中的生化特性、遺傳多樣性及其特異性代謝產(chǎn)物確定其宿主來源的新技術(shù)，從而將非點(diǎn)源污染轉(zhuǎn)換為點(diǎn)源污染[5-8]。其基本原理是：由于攝食、體內(nèi)環(huán)境等不同，可以把包括人在內(nèi)的不同動物的腸道(宿主)看作不同的生態(tài)環(huán)境，生活在不同宿主環(huán)境中的微生物群落，一方面由于對不同環(huán)境脅迫因子的適應(yīng)和競爭能力的差異，導(dǎo)致微生物種群發(fā)生變化，進(jìn)而形成一個區(qū)別于其他環(huán)境的微生物群，亦即具有宿主專一性的種群；另一方面，不同宿主腸道內(nèi)同種微生物則為了適應(yīng)所處的不同生態(tài)環(huán)境，在功能上產(chǎn)生了一系列特異環(huán)境適應(yīng)性，并將這些特性遺傳給子孫后代，從而使這類微生物都帶有標(biāo)志其宿主或生存環(huán)境的特異性指紋圖譜(如：特殊代謝產(chǎn)物、遺傳學(xué)特征等)。通過分析這些宿主特異性微生物或特異性指紋圖譜，就能夠達(dá)到識別糞便污染源的目的。

MST方案主要由源指示物的選擇、源指示物的檢測和源解析3部分組成。源指示物是一些用來標(biāo)示不同糞便污染源的微生物或特殊的化學(xué)物質(zhì)；源指示物的檢測是指使用實(shí)驗(yàn)室分析方法檢測源指示物及其特異性指紋圖譜的方法；源解析是指將檢測結(jié)果同已知糞便源的特異性指紋圖譜進(jìn)行比較，從而確定測試污染水樣中的糞便污染源的過程[9]。

腸球菌(Enterococcus)主要存在于糞便、尿液中，寄存在動物腸道內(nèi)，是一種常用的檢測水體中糞便污染的指示微生物。傳統(tǒng)檢測腸球菌的方法為選擇性培養(yǎng)，該方法操作復(fù)雜、耗時長、培養(yǎng)基成本高[10]。由于腸球菌的毒力因子中esp基因的檢出率較高[11]，且其基因結(jié)構(gòu)非常特殊，本文利用esp基因指示腸球菌的存在的方法具有良好的可靠性。esp基因最初是在研究一株曾引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行的多重耐藥糞腸球菌(MMH594)時發(fā)現(xiàn)的(GenBank序列號為AF034779)。后來又在同一菌株中大小為153 kb的毒力島中發(fā)現(xiàn)了該基因的存在。腸球菌表面蛋白基因esp位于腸球菌染色體上，基因結(jié)構(gòu)非常獨(dú)特，核心區(qū)由多個堿基序列組成。其中，5'端是1～3個A片段的核苷酸序列重復(fù)；3'端是占整個esp基因31%，高度保守的3～9個C片段的序列；2個B片段序列位于A和C片段的序列之后，基因水平的同源重組決定了重復(fù)片段核苷酸序列重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)。目前，腸球菌esp基因作為糞便污染指示的工作在國外常有報道[12-14]，且檢測人源糞便污染的特異性達(dá)到100%。

JC病毒(JCV)屬乳多空病毒科多瘤病毒種人多瘤病毒分支[15]，Padgett等[16]于1971年首次分離出JC病毒，研究表明，JC病毒與人類多瘤病毒SV40(恒河猴病毒)和BK病毒基因組的大小結(jié)構(gòu)及序列非常類似，沒有包膜，外被衣殼蛋白，內(nèi)含一環(huán)狀的小雙鏈DNA。JC病毒基因組包括大功能區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)和非編碼調(diào)節(jié)區(qū)上游編碼區(qū)表達(dá)大T抗原和小t抗原，下游編碼區(qū)表達(dá)蛋白(主要衣殼蛋白)、VP2蛋白、VP3蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，非編碼調(diào)節(jié)區(qū)包括啟動子增強(qiáng)子和復(fù)制起始位點(diǎn)。美國調(diào)查表明半數(shù)以上兒童和大多數(shù)的成年人病毒抗體呈陽性[17]，且由于病毒在腎臟組織中復(fù)制并通過尿液排出[18]，故一般成年人尿液中可以檢測到JC病毒，所以JC病毒可以作為分子marker識別水體中人源污染。近幾年，JCV作為分子標(biāo)記物來檢測地表水中人源污染的工作在美國、澳大利亞等國家已經(jīng)展開。

本文選取的重點(diǎn)流域典型水源地的主要類型主要是水庫、河道、地下水，多用于供給城市生活用水、市政用水、工業(yè)用水、農(nóng)業(yè)用水，同時兼顧發(fā)電、養(yǎng)殖、旅游等，與城市居民的生活密切相關(guān)。運(yùn)用基于esp基因和JCV標(biāo)記的MST技術(shù)對其進(jìn)行檢測，確定是否受到人源糞便的污染，為監(jiān)測和防治水源地的水體污染提供數(shù)據(jù)支持，幫助識別非點(diǎn)源污染關(guān)鍵源區(qū)，制定合理的治理方案。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1主要的試劑與設(shè)備

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，細(xì)菌基因組提取試劑盒，2×Taq Platium PCR Mastermix，北京TIANGEN；LB培養(yǎng)基，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Ex-TaqDNA聚合酶，大連TAKARA。

安全操作柜(ESCO Class II，新加坡)；電子天平(METTER，瑞士)；H203程控金屬浴(GingkoBio，北京)；T-512基因擴(kuò)增儀(Techne，英國)；電泳儀(Bio-Rad，美國)；凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；5804 R冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)；90 min不銹鋼換膜過濾器(MUlipore，美國)；MF-Millipore濾膜 (Millipore，美國)；15 mL 離心式過濾器 (Millipore，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集

于2012年7月到11月期間分別在遼河流域、海河流域、淮河流域、黃河流域和長江流域5個典型水源地，用滅菌的、干凈的玻璃器皿采集水樣后冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)處理。采樣點(diǎn)信息如表1所示。

表1　采樣點(diǎn)信息

1.2.2多瘤病毒JCV檢測方法

1.2.2.1樣品處理方法

在500 mL水樣中添加5 mL濃度為250 mmol·L-1的AlCl3，水樣由蠕動泵傳送用過濾器過濾。隨后，將200 mL濃度為0.5 mmol·L-1的H2SO4溶液(pH=3)通過過濾膜，以去除Al3+離子和其他的陽性離子。然后，用10 mL濃度為1 mmol·L-1的NaOH溶液(pH=11)洗脫病毒，濾出液中添加50 μL濃度為100 mmol·L-1的H2SO4溶液(pH=1)以及100 μL的100×Tris-EDTA緩沖液(pH=8)中和。10 mL過濾液進(jìn)一步用Amicon ultra15超濾管濃縮至700 μL左右，置于-20 ℃條件下保存。

1.2.2.2水樣總DNA的提取

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)購自北京天根生物技術(shù)有限公司，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總DNA的提取。

1.2.2.3多瘤病毒(JCV)PCR檢測方法

參照文獻(xiàn)設(shè)計引物HPyV-F、HPyV-R[19]，由上海生工生物工程股份有限公司合成，擴(kuò)增片斷為176 bp(JCV)，詳見表2。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系如下：12.5 μL 2×Taq Platium PCR Mastermix、1 μL引物HPyV-F、1 μL引物HPyV-R、5.5 μL RNase-free ddH2O、5 μL DNA模版，反應(yīng)體系共25 μL。以多瘤病毒質(zhì)粒作為陽性對照，以RNase-free ddH2O作為空白對照。反應(yīng)條件如下：94 ℃起始變性3 min后，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸50 s，并循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用Bio-Rad公司凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.3屎腸球菌檢測方法

1.2.3.1樣品處理方法

取100 mL水樣過膜(孔徑0.45 μm，直徑50 mm)，將膜貼至mEI培養(yǎng)基上，41 ℃培養(yǎng)48 h。將膜轉(zhuǎn)移至10 mL TSB培養(yǎng)液中，41 ℃溫育3 h。

1.2.3.2DNA的提取

按天根細(xì)菌基因組DNA extract kit試劑盒說明書提取。

1.2.3.3屎腸球菌esp基因檢測方法

參照文獻(xiàn)設(shè)計引物esp2-F和esp2-R[20-22]，由北京奧科公司合成，擴(kuò)增片斷為407 bp，詳見表2。

PCR反應(yīng)體系如下：5 μL 10×Ex-Taq buffer、1 μL 10 mmol·L-1dNTP、1 μL引物esp2-F、1 μL引物esp2-R、0.25 μL Ex-Taq DNA聚合酶、32.75 μL RNase-free ddH2O，反應(yīng)體系共50 μL。以陽性菌作為陽性對照，以RNase-free ddH2O作為空白對照。反應(yīng)條件如下：95 ℃起始變性15 min后，94 ℃變性30 s，52.0 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，并循環(huán)30次，最后72 ℃延伸7 min，反應(yīng)結(jié)束后保存在4 ℃條件下備用。

取10 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用Bio-Rad公司凝膠成像儀觀察并拍照。

表2　引物序列

2　結(jié)果(Results)

五大流域典型水源地的指示人源糞便污染的病毒與細(xì)菌分子標(biāo)記結(jié)果匯總?cè)缦?表3)，“+”表示陽性結(jié)果，“-”表示陰性結(jié)果；各流域具體檢測結(jié)果詳述于如下文。

2.1遼河流域5個典型水源地檢測結(jié)果

在遼河流域典型水源地采樣點(diǎn)中多瘤病毒檢測

圖1　遼河流域典型水源地水中多瘤病毒(左)和屎腸球菌(右)檢測結(jié)果注：M：Marker Ⅰ，至上到下條帶依次為600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；CK：空白對照；S：標(biāo)準(zhǔn)品；1：QH水庫；2：GYG水庫；3：HR水庫；4：QH水庫；5：DHF水庫。Fig. 1　Detection of JCV and esp gene in Liaohe River basinNote: M: Marker I, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp from top to bottom; CK: Control check; S: Salvicine; 1: QH reservoir; 2: GYG reservoir; 3: HR reservoir; 4: QH reservoir; 5: DHF reservoir.

5個點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，腸球菌esp基因檢測中采樣點(diǎn)HR水庫、QH水庫、DHF水庫呈陽性結(jié)果，表明這5個點(diǎn)有可能受到了人源糞便的污染，HR水庫、QH水庫和DHF水庫受到人源糞便污染的可能性較大(圖1)。

2.2海河流域4個典型水源地檢測結(jié)果

海河流域典型水源地采樣點(diǎn)中多瘤病毒檢測4個點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，腸球菌esp基因檢測中4個點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，所以這4個點(diǎn)受到人源糞便污染的可能性較大(圖2)。

圖2　海河流域典型水源地水中多瘤病毒(左)和屎腸球菌(右)檢測結(jié)果注：M：Marker Ι，至上到下條帶依次為600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；CK：空白對照；S：標(biāo)準(zhǔn)品；1：DHT水庫；2：PJK水庫；3：DWS水庫；4：YQ水庫。Fig. 2　Detection of JCV and esp gene in Haihe River basinNote: M: Marker I, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp from top to bottom; CK: Control check; S: Salvicine; 1: DHT reservoir; 2: PJK reservoir; 3: DWS reservoir; 4: YQ reservoir.

2.3淮河流域5個典型水源地檢測結(jié)果

在淮河流域典型水源地采樣點(diǎn)中多瘤病毒檢測5個點(diǎn)均呈陰性結(jié)果，但是腸球菌esp基因檢測中5個采樣點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，這說明5個采樣點(diǎn)也有可能受到了人源糞便的污染(圖3)。

2.4黃河流域5個典型水源地檢測結(jié)果

在黃河流域典型水源地采樣點(diǎn)中多瘤病毒檢測采樣點(diǎn)DK和采樣點(diǎn)WJZ水庫呈陽性結(jié)果，腸球菌esp基因檢測中5個點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，表明這5個點(diǎn)有可能受到了人源糞便污染的污染，其中DK和WJZ水庫受到污染的可能性較大(圖4)。

2.5長江流域5個典型水源地檢測結(jié)果

在長江流域典型水源地采樣點(diǎn)中多瘤病毒檢測5個點(diǎn)均呈陰性結(jié)果，但是腸球菌esp基因檢測中5個點(diǎn)均呈陽性結(jié)果，這說明5個采樣點(diǎn)也有可能受到了人源糞便的污染(圖5)。

表3　各流域病毒與細(xì)菌檢測結(jié)果匯總

圖3　淮河流域典型水源地水中多瘤病毒(左)和屎腸球菌(右)檢測結(jié)果注：M：Marker Ι，至上到下條帶依次為600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；CK：空白對照；S：標(biāo)準(zhǔn)品；1：BGS水庫；2：HH水源地；3：HZ水廠；4：DX水源地；5：BBZS水源地。Fig. 3　Detection of JCV and esp gene in Huaihe River basinNote: M: Marker I, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp from top to bottom; CK: Control check; S: Salvicine; 1: BGS reservoir; 2: HH water source; 3: HZ water works; 4: DX water source; 5: BBZS water source.

圖4　黃河流域典型水源地水中多瘤病毒(左)和屎腸球菌(右)檢測結(jié)果注：M：Marker Ι，至上到下條帶依次為600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；CK：空白對照；S：標(biāo)準(zhǔn)品；1：DK；2：XCQ；3：HYK；4：WJZ水庫；5：LJ水庫。Fig. 4　Detection of JCV and esp gene in Yellow River basin Note: M: Marker I, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp from top to bottom; CK: Control check; S: Salvicine; 1: DK; 2: XCQ; 3: HYK; 4: WJZ reservoir; 5: LJ reservoir.

圖5　長江流域典型水源地水中多瘤病毒(左)和屎腸球菌(右)檢測結(jié)果注：M：Marker Ι，至上到下條帶依次為600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp；CK：空白對照；S：標(biāo)準(zhǔn)品；1：TK；2：S水廠；3：THX；4：WJ；5：WLM。Fig. 5　Detection of JCV and esp gene in typical water sources of Yangtze River basinNote: M: Marker I, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp from top to bottom; CK: Control check; S: Salvicine; 1: TK; 2: S water works; 3: THX; 4: WJ; 5: WLM.

3　討論(Discussion)

本研究以腸球菌和多瘤病毒作為MST中的指示微生物，選定腸球菌的esp基因和多瘤病毒基因?yàn)闃?biāo)記基因，通過對標(biāo)記基因的檢測和鑒定追蹤選定微生物，最終達(dá)到了識別水體中人源糞便污染的目的。腸球菌的esp基因和多瘤病毒作為指示人源糞便污染的2種微生物指示物分子標(biāo)記在國外已經(jīng)被應(yīng)用于水體的檢測，文獻(xiàn)報道它們的特異性和靈敏度都是100%。從結(jié)果可以看出，對某些采樣點(diǎn)結(jié)果不是完全一致的，即2種標(biāo)記不是同時呈陽性結(jié)果或陰性結(jié)果。如果某采樣點(diǎn)受到了人源糞便的污染，理論上腸球菌和多瘤病毒JCV是都存在于該采樣點(diǎn)水體中的，即對應(yīng)標(biāo)記基因是全部可以檢測到的。這種陰陽結(jié)果不同的原因可能是，沒有檢測到的某種微生物在水體中的濃度低或短時間內(nèi)的變化，抑或用來檢測的水樣由于受到取樣點(diǎn)選擇和風(fēng)力等自然因素等原因，從而導(dǎo)致沒有檢測到。由此可見，為了更準(zhǔn)確的追蹤污染源，選用不同類型的微生物，甚至是選用不同的方法同時對水源地進(jìn)行檢測是很有必要的。到目前為止，任何一種方法都不能適用于各種環(huán)境條件下的糞便示蹤，需要選取合適的方法，甚至多種不同的方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)缺互補(bǔ)將是MST的發(fā)展趨勢[23]。本文建立的檢測方法，操作簡便、特異性高。根據(jù)本文結(jié)果可以判斷，此方法在我國水源檢測中具有應(yīng)用可行性。

利用微生物源追蹤分析，一方面可以確定非點(diǎn)源污染的來源，以采取針對性強(qiáng)的治理措施；另一方面可以為此類污染負(fù)荷控制提供有力的技術(shù)支持。美國、澳大利亞和歐盟部分國家已經(jīng)開展了一些MST技術(shù)的相關(guān)工作。美國多條河流或海岸線都已采用該方法成功解決污染源頭的問題，如在美國的維多利亞2處海灘Anderson和Hilton地區(qū),其污染物主要來源于人，并針對此研究結(jié)果采取了行之有效的整治措施[24]。該方法已經(jīng)被美國環(huán)境保護(hù)署(US EPA)列入水體監(jiān)測的常規(guī)手段之一。我國目前主要通過檢測細(xì)菌總數(shù)和糞大腸菌群值以及“三氮”(氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮)含量對水體進(jìn)行相關(guān)監(jiān)測和評價，水中糞大腸菌群值及氨氮增高時，表示水體新近可能有糞便污染。但是這些方法都只能對水體污染做出衛(wèi)生學(xué)評價，卻無法查找水體中糞便污染來源。對于非點(diǎn)源污染源生物追蹤技術(shù)研究，國內(nèi)仍然是處于起步階段。2005年，長江水資源保護(hù)科學(xué)研究所通過技術(shù)引進(jìn)和合作，并在丹江口庫區(qū)進(jìn)行了MST技術(shù)應(yīng)用試點(diǎn)。李偉偉等[25]應(yīng)用建立的rep-PCR微生物源追蹤方法區(qū)分水體中指示菌的不同來源，水體標(biāo)本監(jiān)測顯示了桂五水庫糞便污染來源種類多，其中人、雞和牛相對較多，研究結(jié)果提示應(yīng)對桂五水庫地區(qū)加強(qiáng)人、家禽和家畜動物糞便的無害化管理。根據(jù)本研究的結(jié)果，建議五大水源地周邊的居民區(qū)應(yīng)該加大廁所改造力度，增進(jìn)糞便無害化處理,并且對居民普及相關(guān)的水源衛(wèi)生與健康知識。

MST是一個新興的監(jiān)測領(lǐng)域，尚處于不斷探索發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證階段，在未來的環(huán)境檢測中，MST的目標(biāo)絕不僅是定性，它的最終目標(biāo)是定量。在定量檢測中也建議同時用多種分子標(biāo)記,這樣做的好處是可以計算出不同宿主來源類便污染的相對值，比如人和某種動物。未來可以利用這項(xiàng)技術(shù)做成芯片[26]，處理結(jié)果的方式可能往往是利用模型[27-28]?？傊?，MST技術(shù)還有很大的探索空間，該技術(shù)的不斷完善必然會給水體檢測帶來更大的便利，給監(jiān)測水體、控制污染源及制定相關(guān)環(huán)保條例提供更多可以利用的科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心水生態(tài)毒理組和公共儀器組對本研究的支持。

通訊作者簡介：何曉青(1977-)，女，博士，副教授，從事水環(huán)境中微生物學(xué)的研究。

[1]Line D E, McLaughlin R A, Osmond D L, et al. Nonpoint Sources [M]. Water Environment Research, 1998: 895-912

[2]Parry R. Agricultural phosphorus and water quality: A US environmental protection agency perspective [J]. Journal of Environmental Quality, 1998, 27(2): 258-261

[3]賀纏生, 傅伯杰, 陳利頂. 非點(diǎn)源污染的管理與控制[J]. 環(huán)境科學(xué), 1998, 19(5): 87-91

He C S, Fu B J, Chen L D. Non-point source pollution control and management [J]. Environmental Science, 1998, 19(5): 87-91 (in Chinese)

[4]Meays C L, Broersma K, Nordin R, et al. Source tracking fecal bacteria in water: A critical review of current methods [J]. Journal of Environmental Management, 2004, 73(1): 71-79

[5]Ruecker N J, Braithwaite S L, Topp E, et al. Tracking host sources of Cryptosporidium spp. in raw water for improved health risk assessment [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(12): 3945-3957

[6]Jiang S C, Chu W, Olson B H, et al. Microbial source tracking in a small southern California urban watershed indicates wild animals and growth as the source of fecal bacteria [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(4): 927-934

[7]Anderson M A, Whitlock J E, Harwood V J. Diversity and distribution of Escherichia coli genotypes and antibiotic resistance phenotypes in feces of humans, cattle, and horses [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(11): 6914-6922

[8]Whitlock J E, Jones D T, Harwood V J. Identification of the sources of fecal coliforms in an urban watershed using antibiotic resistance analysis [J]. Water Research, 2002, 36(17): 4273-4282

[9]Seurinck S, Verstraete W, Siciliano S D. Microbial source tracking for identification of fecal pollution [J]. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology, 2005, 4(1-2): 19-37

[10]US EPA. Method 1600: Enterococci in water by membrane filtration using membrane Enterococcus Indoxyl-3-D-Glucoside Agar (mEI) [R]. Washington DC: US EPA, 2002

[11]吳敏. 糞腸球菌和屎腸球菌毒力基因, PA1相關(guān)基因及耐藥性分析[D]. 廣州: 南方醫(yī)科大學(xué), 2008

Wu M. Presence of virulence genes, PAI-associated genes and antibiotic resistance in E. faecalis and E. faecium [D]. Guangzhou: Southern Medical University, 2008 (in Chinese)

[12]Ahmed W, Powell D, Goonetilleke A, et al. Detection and source identification of fecal pollution in non-sewered catchment by means of host-specific molecular markers [J]. Water Science and Technology, 2008, 58(3): 579-586

[13]Abdelzaher A M, Wright M E, Ortega C, et al. Presence of pathogens and indicator microbes at a non-point source subtropical recreational marine beach [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(3): 724-732

[14]Kim S Y, Lee J E, Lee S, et al. Characterization of Enterococcus spp. from human and animal feces using 16S rRNA sequences, the esp gene, and PFGE for microbial source tracking in Korea [J]. Environmental Science and Technology, 2010, 44(9): 3423-3428

[15]Imperiale M J. The human polyomaviruses, BKV and JCV: Molecular pathogenesis of acute disease and potential role in cancer [J]. Virology, 2000, 267(1): 1-7

[16]Padgett B L, Zurhein G M, Walker D L, et al. Cultivation of papova-like virus from human brain with progressive multifocal leucoencephalopathy [J]. The Lancet, 1971, 297(7712): 1257-1260

[17]Major E O, Amemiya K, Tornatore C S, et al. Pathogenesis and molecular biology of progressive multifocal leukoencephalopathy, the JC virus-induced demyelinating disease of the human brain [J]. Clinical Microbiology Reviews, 1992, 5(1): 49-73

[18]Khalili K, Gordon J, White M K. The Polyomavirus, JCV, and its Involvement in Human Disease [M]// Polyomaviruses and Human Diseases. New York: Springer, 2006: 274-287

[19]Hammerum A M, Jensen L B. Prevalence of esp, encoding the enterococcal surface protein, in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates from hospital patients, poultry, and pigs in Denmark [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(11): 4396-4396

[20]Allard A, Albinsson B O, Wadell G. Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39(2): 498-505

[21]Harwood V J, Delahoya N C, Ulrich R M, et al. Molecular confirmation of Enterococcus faecalis and E. faecium from clinical, faecal and environmental sources [J]. Letters in Applied Microbiology, 2004, 38(6): 476-482

[22]Ahmed W, Stewart J, Powell D, et al. Evaluation of thehost-specificity and prevalence of enterococci surface protein marker in sewage and its application for sourcing human fecal pollution [J]. Journal of Environmental Quality, 2008, 37(4): 1583-1588

[23]段傳人, 劉愛喜, 王貴學(xué), 等. 應(yīng)用腸道微生物示蹤地表水糞便污染的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報, 2013, 40(12): 2319-2329

Duan C R, Liu A X, Wang G X, et al. Research progress of using intestinal microbes to track the sources of fecal pollution in surface water [J]. Microbiology China, 2013, 40(12): 2319-2329 (in Chinese)

[24]Dickerson J W, Hagedorn C, Hassall A. Detection and re-mediation of human-origin pollution at two public beaches in Virginia using multiple source tracking methods [J]. Water Research, 2007, 41(16): 3758-3770

[25]李偉偉, 陳曉東, 顧玲, 等. 應(yīng)用rep-PCR微生物源方法追蹤夏秋季桂五水庫糞便污染來源[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 21(3): 7-9

Li W W, Chen X D, Gu L, et al. Application of rep-PCR microbial source tracking to identify fecal source in Guiwu reservoir in the seasons of summer and fall [J]. Jiangsu Journal of Preventive Medicine, 2010, 21(3): 7-9 (in Chinese)

[26]Stapleton C M, Kay D, Wyer M D, et al. Evaluating the operational utility of a bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water [J]. Water Research, 2009, 43(19): 4888-4899

[27]Roslev P, Bukh A S, Iversen L, et al. Application of mussels as bio samplers for characterization of fecal pollution in coastal recreational waters [J]. Water Science and Technology, 2010, 62(3): 586-593

[28]Soule M, Kuhn E, Loge F, et al. Using DNA microarrays to identify library-independent markers for bacterial source tracking [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(3): 1843-1851

◆

Detection ofEnterococcusespGene and Polyomavirus JCV and Its Application in Typical Water Sources of Five River Basins

Wang Jingqi, Kong Weiwen, Liu Tingting, Chen Nan, Yang Boyun, He Xiaoqing*

College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

9 March 2015accepted 1 June 2015

Currently, non-point source pollution has become the major problem of the water environment. Microbial source tracking (MST) was a novel technique in solving non-point source pollution, which can determine the source of pollution. To study the effect of human fecal contamination in main water source, we selected specific pathogen Enterococcus esp gene and polyomavirus JCV as molecular markers to establish the molecular tracking methods. The markers exhibited high specificity and sensitivity. Five river basins including Liaohe River Basin, Haihe River Basin, Huaihe River Basin, Yangtze Basin and Yellow River Basin were analyzed by the methods. Our results suggested that all of the five typical water sources might have been polluted by human feces contamination. These data can provide important information and technical support for further research.

Enterococcus esp gene; polyomavirus JCV; water sources; MST

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(TD2012-03)；水利部行業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201201032)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(51108029)

王敬琦(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗h(huán)境中病原微生物，E-mail: wangjingqi90@126.com

Corresponding author)， E-mail: lenahe@bjfu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150309013

2015-03-09錄用日期：2015-06-01

1673-5897(2015)6-246-07

X171.5

A

王敬琦, 孔維文, 劉婷婷, 等. 基于esp基因和JCV標(biāo)記的MST方法在五大流域典型水源地中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(6): 246-252

Wang J Q, Kong W W, Liu T T, et al. Detection of Enterococcus esp gene and polyomavirus JCV and its application in typical water sources of five river basins [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 246-252 (in Chinese)