時(shí)粲等

摘要：根據(jù)GenBank中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）基因組序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了植物乳桿菌QL-14的谷氨酸脫羧酶編碼基因gadB，克隆至表達(dá)載體pGEX-4T-3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）后進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)了純化。結(jié)果表明，擴(kuò)增目的gadB基因的開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)1 407 bp，編碼469個(gè)氨基酸，氨基酸序列與植物乳桿菌WCFS1同源性為99.6%。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，得到純化蛋白質(zhì)GAD大小為53.6 ku，等電點(diǎn)為5.58，比活力為9.9 U/mg。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；原核表達(dá)；GST標(biāo)簽蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4328-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.058

γ-氨基丁酸（GABA）作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是目前研究較為深入的哺乳動(dòng)物腦組織的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，具有一系列的生理功能，例如可降血壓[2]、治療癲癇[3]、抗疲勞[4]、提高免疫力[5]等。谷氨酸脫羧酶（GAD）是生物體內(nèi)催化L-谷氨酸經(jīng)α-脫羧為GABA的限速酶[6]。

目前，國(guó)內(nèi)外主要采用化學(xué)合成法、植物富集法和微生物法制備GABA。化學(xué)合成法反應(yīng)條件劇烈，污染嚴(yán)重，不適合食品添加[7]；植物富集法提取的GABA含量較低，提取較為困難[8]；微生物發(fā)酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過程復(fù)雜且生產(chǎn)周期長(zhǎng)[9]。通過基因工程技術(shù)克隆高活性的GAD進(jìn)行體外催化是獲得大量GABA的潛在技術(shù)手段[10，11]。本研究通過克隆植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）QL-14中g(shù)adB基因并在大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行原核表達(dá)，借助大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)及融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3可人工調(diào)控表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行高效表達(dá)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行純化以期獲得有較高活性的GAD，為今后將GAD應(yīng)用于GABA生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌BL21、植物乳桿菌QL-14和質(zhì)粒pGEX-4T-3由廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ以及TA克隆試劑盒購自TaKaRa公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker、氨芐青霉素（AMP）、IPTG購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的植物乳桿菌WCFS1全基因序列（登錄號(hào)：NC004567），針對(duì)其gadB基因用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物lpgadbs/lpgadba，同時(shí)，根據(jù)融合表達(dá)載體pGEX-4T-3上多克隆位點(diǎn)的特征，在兩條引物5′端分別插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（下劃線部分），由上海英俊生物工程有限公司合成。引物序列l(wèi)pgadbs：5′-GGATCCATGGCAATGTTATACGGTA-3′；lpgadba：5′-GAATTCTCAGTGTGTGAATCCGT-3′。

1.2.2 gadB基因的克隆 以植物乳桿菌QL-14菌液為模版，按如下反應(yīng)物體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/μL），10 μL 5×PrimeSTAR Buffer，4 μL dNTP Mixture（各2.5 mmol/L），2 μL模板（菌液），引物lpgadbs/lpgadba（10 mmol/L）各1 μL，添加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，59 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。加20 μL A體系 [13.5 μL 膠回收產(chǎn)物，0.5 μL TaKaRa TaqTM（5 U/μL）， 2 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ free），3 μL dNTP Mixture（各2.5 mmol/L），1 μL MgCl2（25 mmol/L）]，72 ℃反應(yīng)30 min后與pMD18-T載體在16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL AMP的LB平板上進(jìn)行抗性篩選。挑選單克隆經(jīng)PCR、雙酶切驗(yàn)證后送至上海英俊生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pMD18-T-gadB和pGEX-4t-3融合質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，以10∶1的體積比混合后加入T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μL/mL AMP的LB平板上進(jìn)行抗性篩選。挑選單克隆經(jīng)PCR、雙酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá) 取新鮮培養(yǎng)的重組菌菌液1.0 mL（含100 μg/mL AMP）接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL AMP）上，37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)至OD600 nm=0.4～0.6時(shí)加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)完成后取1.0 mL菌液濃縮至150 μL，于12 000 r/min 離心5 min，去上清液后加入2×樣品緩沖液煮沸15 min，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行10%的SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE凝膠配制及電泳條件參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》[12]。endprint

1.2.5 融合蛋白質(zhì)可溶性分析 將誘導(dǎo)后的菌體懸浮于PBS，利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎菌體（35 W，工作2 s間歇1 s，10 min）。將破碎后的菌液6 000 r/min離心10 min，分別取上清液和沉淀進(jìn)行電泳。

1.2.6 GAD的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液400 mL于12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體，用20 mL PBS緩沖液（pH 7.4）懸浮菌體，超聲波破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱，用GST（谷胱甘肽）瓊脂糖凝膠柱對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到純化后的GST-GAD，通過凝血酶Thrombin將標(biāo)簽蛋白質(zhì)GST切除掉，得到目的蛋白質(zhì)GAD。純化后的蛋白質(zhì)含量采用Bradford[13]法測(cè)定，以BSA（牛血清蛋白質(zhì)）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.7 GAD活力的測(cè)定 采用比色法。配制一定量的底物溶液Macllvaine[14]緩沖體系（0.2 mol/L，pH 4.8，含0.02 mol/L底物L(fēng)-谷氨酸鈉），取400 μL底物溶液和200 μL酶液在37 ℃反應(yīng)30 min后煮沸終止反應(yīng)；再加入1.0 mL 6%（V/V）苯酚和1.0 mL次氯酸鈉溶液，充分振蕩后，沸水浴中反應(yīng)10 min，迅速在冰浴中冷卻顯色20 min，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后加入60%乙醇溶液2.0 mL，最后在643.5 nm處測(cè)定吸光度。酶反應(yīng)體系中GABA的量以標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，一個(gè)酶活力單位（U）定義為在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 gadB基因的克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

gadB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后可見一段約1 400 bp的特異性條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)1 410 bp，含全長(zhǎng)為1 407 bp的開放閱讀框（ORF）編碼序列?？寺〉膅adB基因序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為KJ542619，氨基酸序列登錄號(hào)為AHY84727。

pMD-18-gadB與pGEX-4T-3分別經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL AMP的LB平板上進(jìn)行抗性篩選。挑選單克隆培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR及雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明目的基因成功地克隆到融合表達(dá)載體pGEX-4T-3中。對(duì)測(cè)序后的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)其序列與植物乳桿菌WCFS1的氨基酸序列僅存在兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，同源性較高，為99.6%。

2.2 gadB基因重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

根據(jù)“1.2.4”所述，分別從IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。從SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，在大約79 ku處有明顯條帶，說明融合蛋白質(zhì)已經(jīng)得到表達(dá)，同時(shí)以空載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)作為對(duì)照。經(jīng)過上述優(yōu)化，確定以IPTG濃度1.0 mmol/L（圖3）、誘導(dǎo)時(shí)間5 h（圖4）、誘導(dǎo)溫度34 ℃（圖5）的條件對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)其表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行可溶性分析。

2.3 融合蛋白質(zhì)可溶性分析結(jié)果

由于使用大腸桿菌pGEX-4t-3高效表達(dá)系統(tǒng)，在一定的誘導(dǎo)條件下重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生后來不及進(jìn)行構(gòu)象化而迅速積累，常形成不可溶的包涵體，這可能影響目的蛋白質(zhì)功能[15]。為此，本研究對(duì)融合蛋白質(zhì)的可溶性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，37 ℃誘導(dǎo)過程中融合蛋白質(zhì)大多以包涵體的形式存在于沉淀中（圖6a），16 ℃誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)大多以可溶性的形式存在于上清液中（圖6b）。為了得到大量的可溶性蛋白質(zhì)，本研究目的蛋白質(zhì)的純化采用16 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4 GAD的純化結(jié)果

重組蛋白質(zhì)通過GST瓊脂糖凝膠柱純化，通過凝血酶切除標(biāo)簽蛋白質(zhì)，并經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，分析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，純化的融合蛋白質(zhì)GST-GAD大小在79 ku左右，標(biāo)簽蛋白質(zhì)GST大小約為26 ku，目的蛋白質(zhì)GAD為53.6 ku，與報(bào)道的目標(biāo)蛋白質(zhì)大小基本一致[16]。圖7中純化后得到相對(duì)單一的條帶，基本確定可以是較純的GAD，經(jīng)測(cè)定，純化后GAD蛋白質(zhì)含量為0.626 mg/mL，等電點(diǎn)為5.58。

2.5 GAD活力的測(cè)定結(jié)果

純化的GAD與底物L(fēng)-谷氨酸鈉在一定條件下反應(yīng)得到GABA，在643.5 nm處檢測(cè)GABA吸光度，后帶入GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U），得到目的蛋白質(zhì)的酶活力。純化后的目的蛋白質(zhì)GAD有較高的活力，總活力為6.2 U/mL，比活力為9.9 U/mg。

3 結(jié)論

通過克隆植物乳桿菌QL-14谷氨酸脫羧酶（共469個(gè)氨基酸），發(fā)現(xiàn)其與GenBank上已發(fā)表的植物乳桿菌L. plantarum WCFS1[17]（GenBank登錄號(hào)：YP 0048490915）的GAD氨基酸序列同源性為99.6%，僅在2個(gè)位點(diǎn)有差異，說明在不同的植物乳桿菌菌株中的GAD氨基酸序列略有差異。

經(jīng)過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)條件與蛋白質(zhì)的表達(dá)量息息相關(guān)，其中隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加表達(dá)量增加明顯，在誘導(dǎo)5 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，誘導(dǎo)溫度的升高致使表達(dá)量的增加也是很可觀的，而IPTG誘導(dǎo)濃度的增加對(duì)目的表達(dá)量增加量影響并不大。尹淑琴等[18]采用同樣的表達(dá)體系進(jìn)行原核表達(dá)所得的最優(yōu)條件為IPTG濃度0.3 mmol/L、誘導(dǎo)溫度32 ℃。說明相同的表達(dá)體系中不同的基因表達(dá)條件不同。重組蛋白質(zhì)可溶性分析中，發(fā)現(xiàn)融合蛋白質(zhì)GST-GAD在37 ℃高溫誘導(dǎo)條件下易形成不可溶的包涵體，不利于純化，所以選擇在16 ℃下過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)經(jīng)GST瓊脂糖凝膠柱純化得到有一定純度的目的蛋白質(zhì)GAD（大小53.6 ku，等電點(diǎn)5.58），并用凝血酶切除掉標(biāo)簽蛋白質(zhì)GST，排除了可能對(duì)GAD活性有干擾的因素。通過酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)純化蛋白質(zhì)GAD總活力為6.2 U/mL，比活力為9.9 U/mg，有較高酶活力，具備工業(yè)催化生產(chǎn)GABA的潛在條件。endprint

綜合上述，本試驗(yàn)成功克隆了植物乳桿菌gadB基因，并構(gòu)建了重組表達(dá)菌株，對(duì)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化并且得到了有較高活性的目的蛋白質(zhì)GAD，為后續(xù)對(duì)GAD性質(zhì)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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