潘 妃，周 榕，丁 旭，王治宇，秦玉芝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院， 湖南 長沙410128）

單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms SNP）標(biāo)記是近年來分子標(biāo)記的研究熱點(diǎn)，具有廣泛分布性、遺傳穩(wěn)定性、易規(guī)?；瘷z測等特點(diǎn)。SNP 自1994年第一次被提出之后，已成為遺傳標(biāo)記研究最多最有前景的分子標(biāo)記。由于豐富的基因組突變位點(diǎn)和高通量檢測平臺的開發(fā)，SNP 迅速占領(lǐng)了分子遺傳學(xué)的中心舞臺。Lander[1]在1996年正式指出SNP 開啟了新的分子標(biāo)記時代，是繼SSR 和ISSR 等二代分子標(biāo)記發(fā)展起來的第三代新型分子標(biāo)記。

1 SNP 標(biāo)記的概念

SNP，即單核苷酸多態(tài)性，主要是指由于單個核苷酸的變異而引起的基因組水平上的DNA 序列多態(tài)性，其形式包括單個堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等[2]。根據(jù)突變的位置可將SNP 劃分為3種形式：一是廣泛分布于基因編碼區(qū)的cSNP；二是存在于基因周邊的pSNP；三是存在于基因間的iSNP[3]。cSNP 經(jīng)常會導(dǎo)致表達(dá)蛋白的多態(tài)性變異，而引起功能的改變。Halushka 等[4]人的研究表明，SNP 在單個基因或者整個基因組的分布并不均勻。在同一條染色體上，SNP也存在明顯的富集區(qū)域和稀缺區(qū)域。SNP 在非轉(zhuǎn)錄序列的出現(xiàn)頻率高于轉(zhuǎn)錄序列，而在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義序列突變的頻率要比其他突變方式低很多。以人類基因組為例，Halushka 等[4]檢測了75個基因，進(jìn)而推測人類基因有近百萬個SNP，其中大約有50 萬個在非編碼區(qū)，24 萬～40 萬個在編碼區(qū)，而這些SNP 與蛋白質(zhì)的功能息息相關(guān)。

2 SNP 標(biāo)記的特點(diǎn)

2.1 突變頻率低，遺傳穩(wěn)定性高

一般而言，SNP 在群體中發(fā)生的頻率不低于1%[5]。在人類基因組中，有些區(qū)域SNP 分布率只有0.1%，有些特異性編碼區(qū)域則達(dá)到了5%～10%，分布極度不均勻，但總體突變率不高，每個核苷酸每年的突變率約為1×10-9%～5×10-9%[6]。

從理論上看，SNP 可以任意發(fā)生于A、G、C、T 之間。但研究表明，SNP 多發(fā)生在T 和C 之間，且兩者的比列是2∶1。在人類基因組中，CpG 二核苷酸的胞嘧啶是最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大部分是甲基化，可自發(fā)地脫去氨基形成胸腺嘧啶[7]。相比串聯(lián)重復(fù)微衛(wèi)星等多態(tài)性標(biāo)記，SNP 標(biāo)記可能由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上后兩種情況出現(xiàn)的幾率非常小，常常被忽略[8]。相較于其他RAPD、SSR、PFLP 等分子標(biāo)記，SNP 標(biāo)記是基于單核苷酸的突變，突變頻率低，與一些不良性狀間也不存在連鎖遺傳。這種基因上的變異屬于可遺傳性變異，遺傳穩(wěn)定性高。

2.2 位點(diǎn)豐富，分布廣泛

SNP 是基因組中分布最廣泛的點(diǎn)突變。Geleron等[9]通過鳥槍法基因測序比較分析了Landsberg（Ler）野生型擬南芥和已知序列的Columbia（Col）型擬南芥，識別出37 344個SNPs。Nasu[10]等比較分析了3個粳稻品種、2個秈稻品種和1個野生稻之間SNP 發(fā)生的頻率，發(fā)現(xiàn)每232個堿基就存在1個SNP。在玉米基因組中，每57個堿基就有1個SNP[11]；在大豆基因組中，每272個堿基就有1個SNP[12]。Lammer 等[13]在對5個大麥品系的54個基因進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，大麥的38個基因中共存在112個SNP。

2.3 檢測快速，篩選規(guī)?；?/h3>

RFLP、RAPD 等傳統(tǒng)分子標(biāo)記都是建立在凝膠電泳基礎(chǔ)上，對多個個體進(jìn)行分析，過程繁瑣、速度慢、耗時長、實(shí)驗(yàn)精度不高、價格昂貴。SNP 標(biāo)記在技術(shù)上擺脫了電泳檢測的過程，進(jìn)行自動化檢測，檢出率也相應(yīng)提高。由于SNP 多由2個等位基因構(gòu)成，又被稱為二等位基因標(biāo)記[14]。因此，在SNP 篩選時，只需對其進(jìn)行+/-的分析，無需分析DNA 片段的長度，這就有利于自動化分析處理來篩選或檢測SNP[15]。SNP 自身所具備的這些特點(diǎn)，使其極大程度上優(yōu)于其他分子標(biāo)記，也為DNA 芯片、構(gòu)建遺傳圖譜等奠定了基礎(chǔ)。但也由于自身的二態(tài)性限制，使得SNP 無法取代RFLP、SSR 等多態(tài)性分子標(biāo)記。SNP 分布位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于SSR 位點(diǎn)，可以通過加大分析密度構(gòu)建遺傳圖譜來精確地進(jìn)行基因定位。

3 SNP 標(biāo)記的開發(fā)

最常用的SNP 開發(fā)途徑有兩種[16]：一是直接測序DNA 的擴(kuò)增片段。其原理是根據(jù)已知序列或者EST庫設(shè)計引物，選擇有代表性的個體進(jìn)行擴(kuò)增，通過比較擴(kuò)增后的產(chǎn)物來發(fā)現(xiàn)差異。這種途徑開發(fā)出來的SNP 假陽性率比較低，但工作量大且成本高。二是利用生物信息學(xué)軟件從核酸數(shù)據(jù)庫中開發(fā)SNP。利用軟件自動識別序列上的多態(tài)性位點(diǎn)，得到疑似SNP，再比對EST 庫得到有效實(shí)際的SNP。玉米、大麥等尚未完成基因組測序的物種，則可以通過這一途徑來發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)[17]。

SLAF-seq 高通量測序技術(shù)可以檢測到SNP、InDel 兩種類型的多態(tài)性差異[18]。其主要的技術(shù)流程包括：基因組DNA 的酶切、構(gòu)建測序文庫、上機(jī)測序以及數(shù)據(jù)分析。該技術(shù)準(zhǔn)確性高、通量高、成本低，常用于關(guān)聯(lián)性圖譜、多態(tài)性圖譜的構(gòu)建。陳士強(qiáng)等[19]利用SLAF-seq 技術(shù)開發(fā)了368個長穗偃麥稻草1E 染色體特異性片段，并利用其中的80個序列開發(fā)出48個長穗偃麥稻草1E 特異性分子標(biāo)記，這些標(biāo)記中包含了20個長穗偃麥稻草1E 染色體特異性分子標(biāo)記，效率高達(dá)25%。

RAD-seq 技術(shù)是在二代測序技術(shù)上發(fā)展起來的一項(xiàng)全基因組酶切位點(diǎn)的簡化測序技術(shù)[20]。其具有不依賴于基因組序列的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高通量的SNP 標(biāo)記的開發(fā)。Baird 等[21]利用八堿基酶sbfⅠ對三刺魚的基因組進(jìn)行酶切，通過RAD 標(biāo)記測序得到14 萬個SNP 標(biāo)記；改用出現(xiàn)頻率更高的六堿基酶EcoRⅠ對兩個性狀不同的親本進(jìn)行酶切，分別得到150 萬和250 萬個SNP 標(biāo)記。兩種不同內(nèi)切酶得到的SNP 的數(shù)量截然不同，雙酶切系統(tǒng)對DNA 的篩選更為嚴(yán)格，通過測序得到的序列也更加準(zhǔn)確。在同等條件下，雙酶切系統(tǒng)的RAD-seq 能夠檢測更多的樣本，大大提高了數(shù)據(jù)的利用率。

隨著高通量測序的發(fā)展，越來越多的測序平臺被開發(fā)。RAD-seq 最常用的測序平臺是Illumina GAΠ和Ill um ina HiSeq 1000，其他常見的還有3730xl 及454，Ion Torrent，SOLiD，PacBio RS 等[22-23]。如表1 所示，不同的平臺其成本、運(yùn)行時間、測序長度均存在一定的差異[24-25]。

表1 不同高通量測序平臺比較

4 SNP 標(biāo)記在園藝作物上的應(yīng)用

4.1 CAPS 標(biāo)記的開發(fā)

CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）標(biāo)記是根據(jù)已發(fā)表的基因序列或EST 庫基因序列來設(shè)計引物，將特異PCR 和限制性內(nèi)切酶相結(jié)合而檢測多態(tài)性的技術(shù)，又稱為PCR-RFLP[26]。其特點(diǎn)包括共顯性、位點(diǎn)特異性、操作簡單和低成本。近年來，CAPS 廣泛應(yīng)用于基因分型、基因定位、圖位克隆和物種親緣關(guān)系鑒定等。束永俊等[27]利用EMBOSS 軟件開發(fā)了簡便易行的SNP 檢測方法，用該軟件篩選導(dǎo)致酶切位點(diǎn)改變的EST-SNP，分別以綏農(nóng)14、合豐25 等9種大豆的DNA 及其混合的DNA 為模板，設(shè)計引物并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)44個PCR 產(chǎn)物中有36個測序峰圖在EST-SNP 位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性。酶切分析發(fā)現(xiàn)其中26個PCR 產(chǎn)物具有酶切多態(tài)性，可以作為CAPS 標(biāo)記，成功率約為72.22%。該EST-SNP 挖掘體系及其CAPS 標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有高效率、低成本等優(yōu)點(diǎn)，有利于促進(jìn)大豆的遺傳育種研究。

4.2 高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

SNP 位于基因組DNA 的部分，由于其二態(tài)性等位性和分布廣泛性，非常適合用于大規(guī)模自動化掃描。在此基礎(chǔ)上繪制而成的高密度遺傳圖譜對分子標(biāo)記輔助育種起著非常重要的作用，可以選擇出與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因，降低甚至消除目的基因以外的其他遺傳背景所帶來的干擾。這項(xiàng)工作在大豆、玉米、水稻、大白菜等重要作物上已經(jīng)取得重大進(jìn)展。肖炳光等[28]以SSR 標(biāo)記遺傳連鎖圖作為骨架，利用基因組簡約法開發(fā)分析了烤煙某群體的SNP 標(biāo)記，獲得包括SNP 標(biāo)記在內(nèi)總數(shù)為1 307 的烤煙遺傳連鎖圖，并且將該遺傳圖譜和普通煙草兩個祖先種的基因組序列相關(guān)聯(lián)，分析了24個連鎖群染色體之間的同源關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了大量染色體之間的重組或交換以及部分染色體之間的共線性。

4.3 SNP 分型

SNP 分型技術(shù)可以分為兩個不同時代，一是早期的凝膠時代；二是新型的高通量時代[29]。凝膠時代的技術(shù)主要包括限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析（RFLP）、寡核苷酸連鎖分析（OLA）以及等位基因特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（AS2PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）。這些技術(shù)與高通量時代的技術(shù)原理基本一致，但由于其不能進(jìn)行自動化分析，只能應(yīng)用于小規(guī)模的SNP 檢測，在實(shí)際應(yīng)用中受到極大的限制。高通量時代的技術(shù)主要有5種，分別是特異位點(diǎn)雜交（ASH）、特異位點(diǎn)引物延伸（ASPE）、單堿基延伸（SBCE）、特異位點(diǎn)切割（ASC）和特異位點(diǎn)連接（ASL）。近年來，“光刻法”原位合成的實(shí)現(xiàn)[30]，可直接在晶體上合成高密度的序列可控的核糖核苷酸，發(fā)揮了DNA 芯片的強(qiáng)大威力，推動了SNP 檢測自動化、批量化的發(fā)展，在構(gòu)建SNP 圖譜上已投入使用[31]。

4.4 抗性相關(guān)的SNP 標(biāo)記的開發(fā)

由于SNP 定位目的基因的準(zhǔn)確性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于園藝作物抗性基因定位。在抗病性的研究上，Hittalmani 等[32]利用SNP 標(biāo)記，最早將抗稻瘟病基因定位于水稻第12 條染色體上靠近著絲點(diǎn)的區(qū)域，具體位于RG241 與RZ397 之間，遺傳距離分別是5.2 cM 和3.3 cM，并將其命名為Pi-ta 基因。Pi-ta 位點(diǎn)上抗感基因的差異僅為1個氨基酸，由于存在1個SNP，原來的GCT 突變?yōu)門CT。正是由于這個氨基酸的變化造就了水稻的抗稻瘟病基因。時克等[33]研究表明，Pi-ta 基因?qū)λ镜疚敛】剐员憩F(xiàn)出很高的水平，可廣泛應(yīng)用于水稻的育種和生產(chǎn)。Laterrot 等[34]利用SNP 標(biāo)記將番茄抗枯萎病基因I-2 定位于第11 染色體的長臂上。徐薪惟等[35]檢測了不同抗性的番茄抗枯萎病基因I-2，發(fā)現(xiàn)了許多SNPs，通過進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)了2個與番茄抗枯萎病相關(guān)的SNP 標(biāo)記，分別是第1 793 位的C→T，第1 963 位的G→A。這是一個螺旋卷曲，有核酸的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致亮氨酸序列出現(xiàn)重復(fù)，構(gòu)成了番茄抗枯萎病基因。劉肖[36]以抗寒性和敏感性藍(lán)莓雜交的F1代為材料，確定與藍(lán)莓抗寒性密切相關(guān)的SNP 標(biāo)記SL8088，并利用該標(biāo)記對F1代實(shí)生苗進(jìn)行鑒定，得到了抗寒性極為突出的2個植株。王彩香[37]以六倍體普通小麥和二倍體野生進(jìn)緣種為材料，采用雙酶切系統(tǒng)RAD-seq 酶切后，檢測TaABC1L 部分基因片段，確定出與小麥抗性相關(guān)的SNP 標(biāo)記，并將其定位于3A、3B 和3D 染色體長臂上。Garg 等[38]成功利用SNP 開發(fā)了與大麥葉銹病抗性基因相關(guān)的標(biāo)記基因Rph7，已廣泛應(yīng)用與大麥抗葉銹病的篩選和育種。此外，在番茄中開發(fā)了與其糖分含量密切相關(guān)的SNP 標(biāo)記Brix9-2-5，該基因堿基的變化導(dǎo)致了其編碼蛋白質(zhì)的變化，影響了番茄中糖分含量[39]。

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