高 文，肖琴云

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福建寧德黑眶蟾蜍染色體核型及其銀染研究

*高 文，肖琴云

（寧德師范學(xué)院生物系，福建，寧德 352100）

以骨髓細胞作為材料制備染色體標本，對福建寧德黑眶蟾蜍()的染色體核型及銀染進行觀察與分析。結(jié)果表明：染色體數(shù)為2n = 22(20M+2SM)，NF = 44，配成11對染色體，由6對大型染色體和5 對小型染色體組成，未發(fā)現(xiàn)與性別分化相關(guān)聯(lián)的異型染色體，染色體未見銀染區(qū)域。與已報道的廣東廣州、福建福州、廣西南寧、浙江溫州、云南騰沖、臺灣等不同地域的黑眶蟾蜍核型等研究資料進行比較，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的黑眶蟾蜍核型在SM數(shù)目和順序、次縊痕或隨體的位置、銀染區(qū)域等方面都存在著一定的差異。

福建寧德；黑眶蟾蜍；染色體核型；銀染

黑眶蟾蜍()屬兩棲綱 (Amphibia)，無尾目(Anura)，蟾蜍科(Bufonidae)，蟾蜍屬()，在中國主要分布在南部地區(qū)[1]。目前在國內(nèi)已報道過不同地域黑眶蟾蜍的相關(guān)資料，如來自廣東廣州、福建福州、廣西南寧、浙江溫州、臺灣、云南騰沖等地方，主要對黑眶蟾蜍的核型等進行了研究[2-7]，但未見對寧德地區(qū)黑眶蟾蜍染色體核型的報道。本研究通過對寧德黑眶蟾蜍的染色體核型和銀染研究，并與廣州、福州、南寧、溫州、臺灣、騰沖六個地區(qū)黑眶蟾蜍的染色體研究結(jié)果進行比較，來探討黑眶蟾蜍不同地理居群的核型和銀染的異同點。研究結(jié)果不僅為該物種的起源、演化與分類等提供科學(xué)依據(jù)，同時也為其遺傳學(xué)和細胞生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料和器材

黑眶蟾蜍10只（雌4雄6），2014年4月初采自福建寧德市城郊。

實驗器材：L550臺式低速離心機、電子天平、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、BA210Digital數(shù)碼顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 制備染色體標本

骨髓細胞染色體標本的制作根據(jù)：秋水仙素—低滲—空氣干燥法[8]來制備染色體標本，并加以適當(dāng)?shù)男薷摹?/p>

1.2.2 觀察染色體組型

取染色體標本玻片，Giemsa染色[9], 鏡檢，計數(shù)80個中期分裂相，選取10個染色體分散好、主縊痕清晰的分裂相進行拍照和記錄。觀察染色體組型，計算染色體的相對長度(%) (1條同源染色體長度/單套基因組染色體總長度×100)和臂比指數(shù)（長短臂之比= 長臂的長度(q)/短臂的長度(p)），按Green等提出的分組標準進行染色體分類，相對長度(%) > 9%的為大型染色體組，相對長度(%) < 7%的為小型染色體組。按照分組標準進行著絲點定位：臂比值在1.0~1.7之間為中部著絲點(M)染色體；在1.7~3.0之間為亞中部著絲點(SM)染色體；在3.0～7.0之間為亞端部著絲點(ST)染色體；大于7.0為端部著絲點(T)染色體。

1.2.3黑眶蟾蜍的銀染（Ag-NORs）

參照Howel和Black的明膠顯示液快速銀染法進行銀染[11]，稍加改進。取10 d內(nèi)的染色體標本玻片，滴加5滴明膠顯影液，再滴加10滴50% AgNO3，混勻后放入預(yù)熱至70 ℃恒溫箱中，顯影10 min后取出，用事先預(yù)熱過的蒸餾水（約70 ℃）沖洗干凈, 后用5%Giemsa復(fù)染1 min，自然空氣干燥后進行鏡檢，在油鏡下觀察染色體分散良好的中期分裂相、確定銀染點，并進行拍照和記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑眶蟾蜍的染色體組型

觀察的80個中期分裂相中，2n = 22占86%，選擇10個分散較好的中期分裂相拍照，按照染色體相對長度的大小順序進行排列并編號（圖1），各號染色體的相對長度(%)和臂比指數(shù)見表1。結(jié)果表明：黑眶蟾蜍的染色體數(shù)目為2n = 22，配成11對同源染色體. 有10對中部著絲點(M)染色體和1對亞中部著絲點(SM)染色體，在第11對染色體上有一對明顯的次縊痕，并在其末端具一對隨體樣特殊標志性特征。在雌、雄個體之間并未發(fā)現(xiàn)與性別分化相關(guān)聯(lián)的異型染色體。

圖1 黑眶蟾蜍染色體的中期分裂相和染色體組型

表1 黑眶蟾蜍的染色體測量統(tǒng)計數(shù)據(jù)（± SE）

Table 1 The chromosome statistical data of Bufo melanostictus

表1 黑眶蟾蜍的染色體測量統(tǒng)計數(shù)據(jù)（± SE）

組別序號相對長度1）臂比值2）著絲點位置3） 116.94 ± 0.911.26 ± 0.06M 215.21 ± 1.321.37 ± 0.19M 312.95 ± 0.531.39 ± 0.22M 411.89 ± 0.421.74 ± 0.12SM 510.82 ± 0.181.26 ± 0.03M 68.61 ± 0.371.45 ± 0.09M 75.94 ± 0.491.30 ± 0.21M 85.44 ± 0.401.39 ± 0.11M 95.11 ± 0.411.29 ± 0.18M 104.60 ± 0.541.29 ± 0.19M 113.87 ± 0.181.57 ± 0.12M

根據(jù)染色體的大小、形態(tài)、相對長度以及臂比指數(shù)等特征，所有染色體可分為2組：

A組為大型染色體（No.1~6），共6對，相對長度(%)為16.94 ± 0.91~ 8.61 ± 0.37。僅第4對為SM型，其余5對均為M型。其中第1對染色體最大，其相對長度(%)大于16.0，很容易識別出來。第3對、第4對和第5對染色體在相對長度上并沒有太大差別（相對長度僅差1左右），但是三者的著絲點位置不一樣，其中第4對染色體的臂比指數(shù)為1.74，屬于SM型，且相對長度在第3～第5對染色體中處于居中長度，因此第4對染色體很容易識別出來。第6對染色體也屬于M型，是大型染色體組里相對長度最小的一對，也容易與其它染色體區(qū)分開來。

B組為小型染色體(No.7~11)，共5對，相對長度(%)為5.94 ± 0.49~3.87 ± 0.18，都是M型。第7對為小型染色體組里最大的一對，其相對長度(%)為5.94 ± 0.49，很容易鑒別出來。第8~第11對染色體的相對長度差別較小，其中第11對是小型染色體組里相對長度最小的，但其臂比指數(shù)卻是小型染色體中最大的，因此很容易被識別。

2.2 黑眶蟾蜍的Ag-NORs

通過Ag-NORs結(jié)果可以看出（圖2），在黑眶蟾蜍的11對染色體中均未出現(xiàn)Ag-NORs。表明其不存在活性或者具有活性較弱的rRNA基因，因此細胞沒有明顯的Ag-NORs出現(xiàn)[12]。

圖2 黑眶蟾蜍的Ag-NORs

3 討論

福建寧德黑眶蟾蜍的染色體：2n = 22(20M +2SM)，NF = 44，為6+5模式。其中No.4為 SM型，其余均為M型，一對次縊痕在11 pter上，并在其末端有一對隨體，通過與其它地區(qū)黑眶蟾蜍染色體核型的比較顯示(表2)，廣東廣州、福建福州、廣西南寧、浙江溫州、臺灣、云南騰沖、福建寧德七個不同地區(qū)黑眶蟾蜍染色體的No.1、2、3、5、6、9、11均為M型。其中高建明[3]報道福建福州的黑眶蟾蜍和馬軍[4]報道的廣西南寧黑眶蟾蜍染色體No.4、No.9均為SM型；何海晏[2]報道廣東廣州的黑眶蟾蜍和劉萬兆等[7]報道云南騰沖的黑眶蟾蜍染色體在No.4、No.7為SM型；錢曉薇[5]報道浙江溫州的黑眶蟾蜍和筆者所報道的福建寧德黑眶蟾蜍No.4為SM型；只有Kuramoto 等[6]報道的臺灣黑眶蟾蜍No.10染色體為SM型。在染色體上的主次縊痕方面，廣東廣州、福建福州、廣西南寧、浙江溫州、云南騰沖、福建寧德六個地區(qū)的一對次縊痕均在11 pter上，且在其末端有一對圓形或長形的隨體，只有臺灣地區(qū)的次縊痕存在于10 pter上。

表2 中國部分地區(qū)黑眶蟾蜍的核型比較

n：二倍體數(shù)目； SM：亞中部著絲點； M：中部著絲點 SC:次縊痕 p：短臂； ter：端區(qū)；

對七個地區(qū)黑眶蟾蜍染色體的Ag-NORs結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，除了廣西南寧和云南騰沖報道的黑眶蟾蜍在第11對染色體的短臂近著絲點區(qū)發(fā)現(xiàn)了明顯的Ag-NORs外，其它地區(qū)黑眶蟾蜍染色體均未發(fā)現(xiàn)Ag-NORs區(qū)域。Ag-NORs所定位的位置和呈現(xiàn)的數(shù)目會隨著物種的不同或改變而存在或大或小的差異，這可能是七個地區(qū)銀染結(jié)果出現(xiàn)差異的原因。這個特性在研究物種的起源、演化與分類起著極其重要的指引作用。

另外我們通過比較發(fā)現(xiàn)，福建寧德黑眶蟾蜍染色體核型所得的結(jié)果與浙江溫州有很大的相似性，與臺灣地區(qū)報道的存在著明顯差異，這可能是由于地域原因引起在染色體核型上的差異。上述七個不同地區(qū)研究結(jié)果表明黑眶蟾蜍的2n均為22，NF=44，均由雙臂染色體組成，可配成11對同源染色體，并可分為大型染色體和小型染色體兩大組，即由6對大型染色體和5對小型染色體組成，核型模式為典型的對稱型（S型）核型[6]。說明各個地域之間的黑眶蟾蜍有很近的親緣關(guān)系，其染色體在遺傳演變上具有相對保守性和同一性[13]。但是不同地理區(qū)域分布的黑眶蟾蜍又存在著明顯而值得注意的差異。這些差異不僅表現(xiàn)在核型組成上，同時還包括在次縊痕和Ag-NORs上的差異。本研究通過對不同地理區(qū)域黑眶蟾蜍核型和銀染研究比較，證實其染色體確實既具有保守性又存在差異。

從核型組成可以看出，七個地區(qū)可分成兩類：20M+2SM、18M+4SM，暗示不同地區(qū)的親緣關(guān)系。但福建的兩個地區(qū)（寧德和福州）卻不完全相同，原因值得探究。另臺灣地區(qū)研究結(jié)果的特殊性：其SM和SC與其他地區(qū)都不一樣，這與其存在地理隔離是否具有相關(guān)性也值得我們進一步探討。探討不同區(qū)域黑眶蟾蜍染色體核型的變化規(guī)律，可為該物種的起源、分類及其演化（進化和系統(tǒng)發(fā)育）等方面提供有價值的資料[14]。

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RESEARCH ON THE KARYOTYPE AND Ag-NORs OF FUJIAN NINGDE

*GAO Wen, XIAO Qin-yun

（Department of Bioengineering, Ningde Normal University, Ningde, Fujian 352100, China）

The observations and analysis ofkaryotype, Ag-NORs were based on the chromosome sample from the bone marrow cells. The results showed that: the number of chromosome was 2n = 22 (20M+2SM), NF = 44, with 11 pairs of chromosomes consisting of 6 pairs of megachromosome and 5 pairs of minisome. No heteromorphic chromosome was found correlating with sex differentiation. No region of the Ag-NORs chromosome was found. Compared with the reported research aboutkaryotype from Guangzhou Guangdong, Fuzhou Fujian, Nanning Guangxi, Wenzhou Zhejiang, Tengchong Yunnan, Taiwan and other different regions, it showed that there were some differences aboutkaryotype from different regions in the SM number and the order, secondary constriction and satellite, Ag-NORs areas and so on.

Fujian Ningde;; karyotype; Ag-NORs.

1674-8085(2015)01-0046-04

Q343.2+2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.009

2014-07-07；修改日期：2014-11-27

*高 文(1966-)，女，福建福鼎人，副教授，主要從事動物生理研究(E-mail:gaowen2004@126.com) ;

肖琴云(1991-)，女，福建福安人，寧德師范學(xué)院生物系2010級生物技術(shù)專業(yè)本科生(E-mail:262354008@qq.com).