響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡果皮可溶性膳食纖維提取工藝和功能特性研究

胡榮鎖++周晶++董文江+趙建平++陸敏泉++宗迎

摘 要 研究旨在應(yīng)用酶法提取咖啡果皮中膳食纖維，為高品質(zhì)膳食纖維提取及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。單因素及響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶法提取咖啡果皮中可溶性膳食纖維的工藝條件，并對(duì)其功能特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：纖維素酶法提取的最優(yōu)提取工藝為：超純水（V）∶咖啡果皮粉（m）=100 mL∶6 g，纖維素酶活添加量為22 FPU/mL，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間2 h，在此工藝條件制備可溶性膳食纖維得率為9.72%；其持水力為（35.72±0.33）g/g，溶脹力為（94.85±0.23）mL/g，結(jié)合水力為（26.97±0.54）g/g。

關(guān)鍵詞 咖啡 ；果皮 ；可溶性膳食纖維 ；酶法提取

分類(lèi)號(hào) TS273

Coffee Peel Soluble Dietary Fiber Extraction Technology

via Response Surface Methodology Optimization

and Functional Characteristics Analysis

HU Rongsuo1，3） ZHOU Jing2） DONG Wenjiang1，3）

ZHAO Jianping1，3） LU Minquan1，3） ZONG Ying1，3）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China；

2 Institute of Tropical Bioseience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China）

Abstract The aim of enzymatic method extract coffee peel soluble dietary fiber was to provide reference of high quality dietary fiber industrialization development. Single factor and response surface methodology as an approach to optimize the extraction technology of coffee peel soluble dietary fiber， while their functional characteristics were briefly analyzed. The results showed that： the optimum extraction process of cellulase extraction was as follows： ultrapure water （V）∶coffee peel powder （m） =100 mL∶6 g， cellulose enzyme activity adding amount was 22 FPU/mL， enzyme solution temperature was 40℃， enzyme solution time was 2 h， in this process condition the coffee peel soluble dietary fiber yield was 9.72 %. The functional characteristics was as follows： retention ability yield was （35.72±0.33） g/g， swelling force yield was （94.85±0.23） mL/g， bound moisture force yield was （26.97±0.54） g/g.

Keywords coffee ； peel ； soluble dietary fiber ； enzymatic method

膳食纖維（dietary fiber，DF）是一類(lèi)不為人體消化利用的非淀粉多糖，包括可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩大類(lèi)[1]。SDF具有比IDF更強(qiáng)的生理功能，如降血脂[2]、調(diào)節(jié)血糖[3]、預(yù)防結(jié)腸癌[4-5]、預(yù)防便秘、糖尿病[6]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[7]和減肥[8]等，因此稱(chēng)之為人體必需的“第七營(yíng)養(yǎng)素”。然而許多天然膳食纖維中SDF含量較低，無(wú)法達(dá)到高品質(zhì)膳食纖維（SDF≥10%）的要求[9]。

云南省咖啡種植面積已突破12萬(wàn)hm2，年產(chǎn)副產(chǎn)物40萬(wàn)t以上，除少量作為肥料還田外，大量堆積廢棄。既是資源的浪費(fèi)，又會(huì)造成環(huán)境污染。對(duì)咖啡副產(chǎn)物綜合利用研究，目前國(guó)內(nèi)只見(jiàn)綜述性論文發(fā)表[10]，而國(guó)外對(duì)咖啡副產(chǎn)物研究較為系統(tǒng)深入，咖啡果皮、咖啡渣、咖啡銀皮、咖啡殼等均有涉獵。在膳食纖維方面僅有咖啡銀皮研究，其水溶性膳食纖維含量達(dá)到總膳食纖維的86%，并將其應(yīng)用到焙烤食品中[11]。

本研究利用響應(yīng)面酶法提取咖啡果皮中的膳食纖維，酶法提取具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、對(duì)環(huán)境破壞小、產(chǎn)品品質(zhì)高的特點(diǎn)，是提取咖啡果皮膳食纖維最佳方式之一。并利用響應(yīng)面法優(yōu)化，以獲得利用商用酶提取膳食纖維提取的最佳工藝條件，旨在為咖啡果皮高品質(zhì)水溶性膳食纖維的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

云南小粒種咖啡果皮由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院協(xié)助收集。纖維素酶為Celluclast 1.5 L，自黑曲霉（Aspergillus niger）中提取，購(gòu)自諾維信公司（Novozymes）公司，無(wú)水乙醇、鹽酸、丙酮等均為分析純，配制用水為超純水。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Master-s-plus UVF超純水系統(tǒng)，上海和泰有限公司；XMTD-8222型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL 104型電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HB 10 digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)iKA公司；Z36HK型離心機(jī)，德國(guó)Hermle公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

收集采用濕法加工的咖啡果皮，采用日曬法干燥，將咖啡果皮水分降至12%以下，保存?zhèn)溆谩?/p>

提取前將咖啡果皮烘干至水分含量5%左右，粉碎，過(guò)20目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖維素酶酶活測(cè)定

酶活測(cè)定采用濾紙酶活法檢測(cè)纖維素酶總酶活，測(cè)定方法采用杜敏的方法[12]。

1.2.3 纖維素酶法提取可溶性膳食纖維

準(zhǔn)確稱(chēng)取咖啡果皮粉，按一定料液比加入超純水，加入一定量的纖維素酶后水浴提取，過(guò)濾，濾液真空濃縮至5～10 mL倒出，加水沖洗濃縮瓶，收集濃縮液和沖洗液，定容至10 mL，加入40 mL無(wú)水乙醇，靜置沉淀1 h，抽濾，于80 ℃烘干濾渣，稱(chēng)重，計(jì)算得率[13]。

1.2.4 SDF得率計(jì)算

SDF得率（%）=[SDF質(zhì)量（g）/咖啡果皮質(zhì)量（g）]×100%

1.2.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素實(shí)驗(yàn)：固定其他條件，分別探討料液比、酶用量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)SDF提取得率的影響。各因素實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)BoX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化SDF提取條件。

1.2.6 膳食纖維的化學(xué)特性測(cè)定

1.2.6.1 持水力[14-15]

稱(chēng)取一定量SDF放入燒杯中，按1∶20 （質(zhì)量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下靜置24 h，在定量濾紙上瀝干樣品水分，并將其迅速轉(zhuǎn)入表面皿中稱(chēng)重。按下式計(jì)算持水力：

持水力=[樣品濕重（g）-樣品干重（g）]/樣品干重（g）

1.2.6.2 膨脹力[14-15]

稱(chēng)取一定量樣品，按l∶20（質(zhì)量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下放置24 h，讀取量筒中液體樣品的體積。按下式計(jì)算膨脹力：

膨脹力=[溶脹后纖維體積（mL）-干品體積（mL）]/樣品干重（g）

1.2.6.3 結(jié)合水力[14，16]

稱(chēng)取一定量SDF放入燒杯中，按1∶20（質(zhì)量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下靜置24 h，在定量濾紙上瀝干樣品水分，將濕樣移入離心管中，在6 000 r/min 條件下離心5 min 后棄去水分，所獲得濕樣所含水分即為結(jié)合水，其與干樣的重量之比即為結(jié)合水力。按下式計(jì)算結(jié)合水力：

結(jié)合水力=[離心后樣品濕重（g）-樣品干重（g）]/樣品干重（g）

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS軟件對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。應(yīng)用Design Expert 8.0.5軟件的BoX-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶總酶活測(cè)定

葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

Celluclast 1.5 L為商用復(fù)合纖維素酶，含有內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和纖維素二糖酶（BG）等多種成分，其酶活未知，因此測(cè)定其總酶活，即濾紙酶活（Filter paper activity，簡(jiǎn)稱(chēng)FPA）。采用Ghose方法[17-19]，進(jìn)行酶活檢測(cè)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，其線(xiàn)性回歸方程y=0.217 8X-0.017 5，R2=0.997 0，由此可知葡萄糖質(zhì)量為2.0 mg時(shí)的吸光度值為0.418 4。

使用紙條纖維酶法檢測(cè)，濾紙酶活檢測(cè)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，其線(xiàn)性回歸方程y=0.863 5X+0.252 9，葡萄糖生成2.0 mg時(shí)，酶濃度為1.980 mL/L。帶入公式（FPA=0.185/生產(chǎn)2 mg葡萄糖時(shí)酶濃度）[20]，得出纖維素酶Celluclast 1.5 L在自然pH值，50℃下的濾紙酶活為93.4 FPU/mL。

2.2 SDF提取單因素實(shí)驗(yàn)

為了提高響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，按實(shí)驗(yàn)方法中所述進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，料液比在0.5（即1∶20）、酶解溫度50℃和酶解時(shí)間3 h時(shí)SDF得率有最大值，雖然隨著酶活添加量的增加SDF增加，但在30 FPU/mL之后增加幅度小，因此酶活添加量選擇30 FPU/mL和其它3個(gè)最大值作為響應(yīng)面分析零點(diǎn)，進(jìn)行下一步分析。

2.3 SDF提取的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的選取及結(jié)果

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、纖維素酶活添加量（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，SDF提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和SDF得率之間的函數(shù)關(guān)系。各實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert軟件對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到SDF得率對(duì)纖維素酶活添加量、pH值、超聲溫度、超聲時(shí)間的回歸模型：

Y=9.37+0.13A-0.19B-0.084C+0.092D-0.34AB-0.52AC-0.16AD+0.035BC+0.21BD+0.49CD-0.85A2-0.49B2-0.26C2-0.13D2

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。

模型的方差分析（表3）表明，失擬項(xiàng)不顯著（p=0.208 8>0.05），而模型p<0.01，模型差異高度顯著，模型確定系數(shù)R2=0.847 5，調(diào)整確定系數(shù)Adj R2=0.695 0，表明模型能較好地反映各因素與響應(yīng)值的變化關(guān)系，可用于預(yù)測(cè)實(shí)際SDF的提取率。在α=0.05顯著水平上剔除不顯著項(xiàng)，得到簡(jiǎn)化方程：

Y=9.37-0.52 AC+0.49 CD-0.85 A2-0.49 B2

2.4 主效應(yīng)分析

各因素的P值可以反映出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，P值越小，表明該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響越大[20]。由表3可知，4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)SDF提取率影響大小依次為酶活添加量>料液比>酶解時(shí)間>酶解溫度。

2.4.1 單因素效應(yīng)分析

回歸方程中的4個(gè)因素任意3個(gè)固定在零水平，將實(shí)驗(yàn)因素分別固定在-1、-0.5、0、0.5、1五個(gè)水平，各因素不同水平的SDF提取率，并以此作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨自變量變化，各因素效應(yīng)呈開(kāi)口向下的拋物線(xiàn)狀。在中心極值點(diǎn)處，咖啡果皮SDF提取率最高，偏離極值點(diǎn)SDF提取率下降，但下降幅度各異，其中A（料液比）下降最大，其次為B（酶活添加量），而D（酶解時(shí)間）下降最小。

2.4.2 兩因素間交互效應(yīng)分析

響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖能夠直觀(guān)地反映出各個(gè)因素及其交互作用，利用Design Expert軟件即可以作出兩因素交互作用的響應(yīng)面圖及其等高線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)主效應(yīng)分析可知酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)SDF得率的影響較小，同時(shí)通過(guò)單因素效應(yīng)分析可知兩者對(duì)得率的影響小，且較為接近，因此兩因素間交互效應(yīng)分析不再進(jìn)行酶解溫度和酶解時(shí)間比較。

2.5 最優(yōu)組合的確定及驗(yàn)證

利用Design Expert軟件對(duì)模型求解，得到咖啡果皮中SDF最優(yōu)提取條件：酶活添加量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解時(shí)間2.00 h、酶解溫度40.00℃，模型預(yù)測(cè)值為9.72%。為驗(yàn)證模型的適用性與可靠性，結(jié)合實(shí)際可操作性，在加酶量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解時(shí)間2.00 h、酶解溫度40.0℃進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，所得SDF平均提取率為9.78%，與預(yù)測(cè)值基本相符。

2.6 膳食纖維功能特性研究

對(duì)咖啡果皮SDF持水力、膨脹力、結(jié)合水力能力進(jìn)行功能檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5 可知，SDF 的持水力、膨脹力、結(jié)合水力能力都較好。說(shuō)明SDF對(duì)于預(yù)防便秘和結(jié)腸癌的發(fā)生具有積極的作用。

3 討論與結(jié)論

SDF提取方法較多，如物理法、化學(xué)法、酶法、化學(xué)酶法、物理酶法等，各方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。酶法反應(yīng)條件溫和，速度快，專(zhuān)一性強(qiáng)，所得SDF純度高、無(wú)異味，因此酶法是工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)SDF最佳提取方法之一。本實(shí)驗(yàn)所使用的為商用復(fù)合纖維素酶，該酶獲得較易，價(jià)格便宜，操作性強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)論可為SDF工業(yè)化提取提供參考。

咖啡果皮SDF最佳得率達(dá)到9.72%，接近高品質(zhì)SDF（≥10%）的要求。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)纖維素酶參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，劉銘等[21]發(fā)現(xiàn)醇沉也會(huì)對(duì)SDF提取造成影響，小于6 h時(shí)SDF得率呈上升趨勢(shì)；Zhang Juan[22]等用6種方法提取SDF，發(fā)現(xiàn)酶法提取得率（6.34%）相對(duì)于物理酶法（68.71%）等幾種方法提取率低，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)咖啡果皮SDF得率也并非最高得率。

對(duì)咖啡果皮SDF持水力、膨脹力、結(jié)合水力進(jìn)行了初步研究，效果良好，說(shuō)明該SDF具有良好的應(yīng)用前景，但其最佳提取方法、組成和功能特性尚需進(jìn)一步研究。

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