王　彬，韓　露，付文力，李靈娟，柴保國

（1.河南牧翔動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州　451162；2.河南省畜牧總站）

不同制備工藝對雙黃連口服液有效成分含量及藥效的影響

王彬1*，韓露2，付文力1，李靈娟1，柴保國1

（1.河南牧翔動物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州451162；2.河南省畜牧總站）

當(dāng)前家禽養(yǎng)殖實踐中，感冒作為高發(fā)性疾病常常給實際生產(chǎn)造成巨大損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康，已經(jīng)成為影響當(dāng)前家禽生產(chǎn)效益的主要疾病之一。感冒類疾病通常分為兩類：一類為因季節(jié)交替、冷熱交替、免疫應(yīng)激等非傳染性因素引起雞群發(fā)病導(dǎo)致的普通感冒，以甩鼻、呼嚕癥狀為主，若表證不除，郁而化熱感染外邪則會發(fā)展成流行性感冒（風(fēng)熱感冒），并進(jìn)一步導(dǎo)致復(fù)合感染，造成其他臟器損傷；另一類為因新城疫及傳支病毒等傳染性因素引起的發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等流行性感冒類，患禽主要表現(xiàn)為低死亡率和輕度的呼吸道感染或產(chǎn)蛋率下降等臨床癥候群，全身器官病變迅速且嚴(yán)重，尤其是心、肺、腎等臟器，免疫系統(tǒng)也遭到破壞，繼發(fā)細(xì)菌感染后易致病程延長，甚至出現(xiàn)高死淘現(xiàn)象。

雙黃連口服液源于《石室密錄》載方連翹湯，早在戰(zhàn)爭年代，人醫(yī)上已用于治療流感、感冒及多種感染病癥；現(xiàn)代藥理證實，該藥具有抗病毒、抗菌、解熱抗炎、提升機(jī)體免疫力等多靶點綜合治療作用，是人醫(yī)及獸醫(yī)臨床用于防治感冒及上呼吸道感染的代表性中成藥之一。酶解法制備雙黃連系《中華人民共和國獸藥典（2010年版二部）》傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上創(chuàng)新應(yīng)用酶解法專利制備工藝（公開號：CN103520284A、CN102895317A）制得的雙黃連口服液。該文主要從不同制備工藝對雙黃連口服液藥效學(xué)影響角度，對通過酶解工藝制備雙黃連口服液在家禽感冒、免疫應(yīng)激方面的防治效果方面進(jìn)行研究。

1　材料

1.1藥物

黃芩、金銀花、連翹藥材，購于鄭州市張仲景大藥房，經(jīng)檢驗均符合《中華人民共和國獸藥典（2010年版二部）》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；提取用鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，購自深圳某公司；生物酶由上海某公司提供Celluclast（纖維素酶）CC102025，活性度為20 000 U/g，

Pentopan Mono BG（木聚糖酶）CF102399，活性度為30 000 U/g；雙黃連口服液（250毫升/瓶），某公司生產(chǎn)（酶 解 法 制備，批號 13060107H、13070507H、13100207H、14060108H）。

1.2試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201215），黃芩素對照品（批號：111595-201005），綠原酸對照品（批號：110753-201314），咖啡酸對照品（批號：110885-201302）木犀草素對照品（批號：111520-201309）連翹苷對照品（批號：110821-201211），以上標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為色譜純。

1.3儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；SPD-10Avp紫外可見檢測器；CLSS-VP色譜工作站；CTO-10ASvp柱溫箱；7725i手動進(jìn)樣器；中藥提取設(shè)備；管式離心機(jī)；中空纖維濾膜；中藥濃縮罐，均為湖南某醫(yī)藥設(shè)備有限公司。

2　試驗方法

2.1雙黃連口服液不同提取工藝樣品制備

處方：黃芩900 g、金銀花900 g、連翹1 800 g，最終制備成2 400 ml藥液。

水提醇沉法（簡稱水醇法，下同）：稱取以上同批次3種生藥，按現(xiàn)有2010版獸藥典二部中所示加水煎煮、醇沉洗脫、濃縮過濾、灌裝滅菌等工藝流程進(jìn)行制備，樣品保留3個重復(fù)；酶解-三級復(fù)合物理除雜法（簡稱酶解法，下同）：稱取以上同批次3種生藥，按照授權(quán)發(fā)明專利（公開號：CN103520284A、CN102895317A）進(jìn)行加水煎煮、酶解（纖維素酶、木聚糖酶）、滅酶、三級物理除雜、濃縮過濾、灌裝滅菌等工藝流程制備的雙黃連口服液，樣品保留3個重復(fù)。

2.2色譜條件

采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，以乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B）為流動相梯度洗脫∶15%A（0 min），25%A（15 min），30%A（20 min），40%A（25 min），40%A（35 min），60%A（45min），檢測波長為280 nm，參比波長：380 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為30℃。理論板數(shù)不低于10 000。

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液的制備精密稱取不同制備工藝的雙黃連口服液樣品各2.0 ml，分別加50%甲醇25 ml，超聲處理30 min，過濾，即得。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取黃芩苷、黃芩素、綠原酸、咖啡酸、木犀草素、連翹苷對照品制成混合對照品溶液（濃度為黃芩苷1.06 mg·ml-1，黃芩素0.083 mg·ml-1，綠原酸0.26 mg·ml-1，咖啡酸0.080 mg·ml-1，木犀草素0.065 mg·ml-1，連翹苷0.13 mg·ml-1）。

2.3.3空白溶液制備取溶劑50%甲醇25 ml，按“3.3.1”項下方法制成空白對照溶液。

2.4不同制備工藝對雙黃連口服液藥效作用的影響

2.4.1風(fēng)熱感冒治療

德惠市南郊某肉雞自養(yǎng)場，大肉食肉雞，3棟雞舍，每棟10 000只。18日齡時3棟雞舍大群均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，癥見發(fā)病雞表現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，羽毛松亂，頭頸卷縮，冠及肉髯發(fā)紺，眼瞼水腫，結(jié)膜發(fā)炎。采食量減少或急驟下降，排黃白綠色稀便。呼吸困難，有啰音，咳嗽、打噴嚏，張口呼吸，鼻孔流出黏性鼻液，剖檢發(fā)現(xiàn)呼吸道尤其是鼻竇，出現(xiàn)炎癥，氣管黏膜充血，每棟雞舍發(fā)病情況大致類似，駐場獸醫(yī)診斷為風(fēng)熱感冒。將3棟雞

舍隨機(jī)分為3組，分別按照表1所示用藥方式進(jìn)行用藥，對試驗雞只按照以下療效評價標(biāo)準(zhǔn)（見表后），進(jìn)行評價打分，并統(tǒng)計試驗結(jié)果，采用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析。

表1　風(fēng)熱感冒臨床試驗各組及用藥情況

治愈率：在用藥5 d內(nèi)，經(jīng)用藥后臨床癥狀基本消失，精神和采食情況恢復(fù)正常者，判定為治愈；每組治愈雞只數(shù)占每組試驗雞只數(shù)的百分率為治愈率。

顯效率：除完全治愈的雞只為有效外，凡試驗期間未死亡，并且癥狀明顯減輕，糞便、精神有所好轉(zhuǎn)，飲水和食欲趨于正常者也視為有效；每組存活且治療有效的雞只數(shù)占每組試驗雞只數(shù)的百分比為有效率。

死亡率：凡在試驗期間死亡，剖檢有特征性病變者判為死亡；死亡雞只數(shù)占每組試驗雞只數(shù)的百分率為死亡率。

2.4.2免疫應(yīng)激引起的普通感冒預(yù)防

山東章丘某商品蛋雞自養(yǎng)場，6棟雞舍，每棟5 000只，220日齡海蘭褐開產(chǎn)蛋雞，隨機(jī)選取同朝向3棟雞舍分為3組，防疫前5 d使用藥物，按照標(biāo)準(zhǔn)化蛋雞防疫流程進(jìn)行防疫（200～220 d，新城疫-H9二聯(lián)油苗0.5毫升/只頸部或胸部皮下注射），各組藥物3 d一個療程，觀察各組預(yù)防家禽疫苗免疫應(yīng)激產(chǎn)生呼吸道效果，并依據(jù)上述療效評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計。

通常應(yīng)激反應(yīng)有甩頭、流淚、打噴嚏、呼嚕、咳嗽等癥狀，這種反應(yīng)在免疫接種2 d出現(xiàn)，之后一周內(nèi)反應(yīng)較重，以后逐漸減輕，有的會出現(xiàn)精神不振、采食減少、排綠色糞便等現(xiàn)象，嚴(yán)重的會引起死亡。依據(jù)臨床用藥程序，按照表2所示三組不同用藥方式進(jìn)行用藥。

表2　預(yù)防免疫應(yīng)激感冒試驗分組情況

3　結(jié)果與討論

3.1不同提取工藝對雙黃連口服液活性成分收率的影響

現(xiàn)代研究證實，雙黃連口服液主要藥效成分除了黃芩苷、綠原酸、連翹苷外尚有黃芩素、木犀草素等多種活性成分，傳統(tǒng)水醇法制備方法存在工藝成本較高、活性成分損失率高、操作周期長等缺點，通過試驗測定結(jié)果可以看出，該試驗通過創(chuàng)新應(yīng)用專利酶解-物理除雜技術(shù)，運(yùn)用復(fù)合酶高效、專性裂解細(xì)胞壁的特性并有機(jī)融合三級復(fù)合物理除雜工藝，使酶解法制備雙黃連口服液6種主要活性成分收率較傳統(tǒng)水醇法提升幅度在30%左右，其中，黃芩苷、綠原酸含量極顯著高于常規(guī)提取工藝（P<0.01），連翹苷等其余成分也顯著高于常規(guī)含量（P<0.05），能明顯提升雙黃連口服液產(chǎn)品品質(zhì)。如表3所示。

3.2不同制備工藝對雙黃連口服液藥效作用的影響

3.2.1風(fēng)熱感冒治療

從表4試驗結(jié)果可以看出：酶解法雙黃連樣品配合治療風(fēng)熱感冒防治效果優(yōu)于水醇法樣品和對照治療組，這可能與生物酶法提取的雙黃連所含黃芩苷、連翹苷、黃芩素、木犀草素等抗感染活性成分含量高，能夠更有效的抑殺病毒、細(xì)菌等病原，提高機(jī)體免疫力及抗病能力，從而使機(jī)體抗病能力更強(qiáng)，治愈率更高，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表3　不同雙黃連制備工藝有效成分含量比較　　單位：mg·ml-1

表4　各組防治風(fēng)熱感冒臨床試驗結(jié)果

3.2.2免疫應(yīng)激引起的普通感冒預(yù)防

根據(jù)試驗結(jié)果統(tǒng)計（詳見表5），酶解法制備雙黃連組防疫后第4天才有個別雞只產(chǎn)生呼吸道癥狀，發(fā)生比率估測在2%以內(nèi)，優(yōu)于水醇法組（防疫后4天呼吸道癥狀發(fā)病率5%左右），空白對照組第2天即產(chǎn)生疫苗應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)生比率在7%～10%之間，初步臨床試驗說明酶解法制備雙黃連組效果優(yōu)于水醇法。

表5　各組預(yù)防免疫應(yīng)激性普通感冒臨床試驗結(jié)果

3.3小結(jié)

中藥酶解提取技術(shù)是利用酶反應(yīng)高度專一的酶來降解植物細(xì)胞壁，從而提高有效成分的溶出率，試驗結(jié)果證明，通過生物酶解法提取口服液6種主要活性成分比傳統(tǒng)水醇法活性成分收率要提高30%左右，二者具有顯著差異。進(jìn)一步通過臨床對家禽風(fēng)熱感冒及免疫應(yīng)激性普通感冒的試驗比較，證實了酶解法提取的雙黃連口服液臨床治療效果要明顯優(yōu)于水醇法雙黃連口服液，且對風(fēng)熱感冒治愈率能夠達(dá)到接近90%左右，具有一定的臨床應(yīng)用優(yōu)勢。同時，新工藝顯著增加黃芩苷、綠原酸、木犀草素等抗感染活性成分提取率，上述結(jié)果說明，酶解法制備雙黃連口服液可能是通過有效抗感染活性成分收率提升增加對風(fēng)熱感冒等治愈率。

4　討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床實踐證明，雙黃連口服液中的黃芩具有清肺熱、解肌表之熱的功效，而金銀花配合連翹具有辛涼解表之功效，其解熱的機(jī)理就是作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使機(jī)體產(chǎn)熱量減少，體溫下降；金銀花活性成分能夠抑制耐藥菌蛋白質(zhì)合成，阻斷病原體的代謝和繁殖，從而抑制和殺滅病原微生物，黃芩苷具有抑制病毒復(fù)制的功能，從而阻斷病毒的增殖，起到抗病毒的作用，連翹中的金絲桃素同樣也具有抗病毒的作用，其抗病毒機(jī)制為阻斷蛋白質(zhì)和核酸的合成；大量研究證實，雙黃連可促進(jìn)溶血素的生成，對機(jī)體的免疫有增強(qiáng)作用，主要是增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞免疫，此外還能夠提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)補(bǔ)體效價從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

免疫應(yīng)激是非常復(fù)雜的生理反應(yīng)，涉及到免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌等系統(tǒng)。一般認(rèn)為機(jī)體主要通過下丘腦一垂體-腎上腺軸（HPA）系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，糖皮質(zhì)激素是HPA軸的最終產(chǎn)物，由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的主要有皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇等，對免疫系統(tǒng)具有廣泛的作用。機(jī)體參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的途徑除HPA軸外，還需要垂體-甲狀腺系統(tǒng)參與。在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，可能由于機(jī)體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)激素和甲狀腺素升高，使機(jī)體的細(xì)胞免疫功能受到抑制，機(jī)體更易受到外源感染威脅，引起感冒發(fā)熱、咳嗽等病癥?，F(xiàn)代藥理研究證實，雙黃連所含苷元（黃芩黃酮、連翹酯苷）成分能夠緩解家禽細(xì)胞及體液免疫抑制，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，提升機(jī)體免疫力，這可能也是雙黃連能夠預(yù)防通風(fēng)不良、忽冷忽熱以及免疫應(yīng)激等所致的普通感冒的作用機(jī)制之一。

雙黃連口服液是目前市場認(rèn)知度較高的獸用抗感染產(chǎn)品，其抗病毒、抗菌、解熱抗炎方面多效藥理作用的發(fā)揮有賴于主要活性成分最大限度被提取出來，該試驗研究了新型酶解提取雙黃連工藝，在這方面做了有益嘗試，并在防治家禽感冒病癥方面取得了理想的應(yīng)用效果?！?/p>

王彬（1982-）男，臨床獸醫(yī)學(xué)碩士，從事中獸醫(yī)藥研究，hongyi2012@126.com。