楊玲　安麗　付佩勝

摘要：采用半致死濃度法，對4種鯉（東平湖鯉、建鯉、俄羅斯鯉及德國鏡鯉）對柱狀黃桿菌引起的柱形?。礌€鰓?。┑目共×M(jìn)行了試驗研究，分別采用1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105 cfu/mL濃度的柱狀黃桿菌G4菌株菌液浸泡攻毒1 h，參考Reed-Muench法計算半致死濃度（LC50）。結(jié)果表明，東平湖鯉LC50為104.7174 cfu/mL；建鯉LC50為104.6821 cfu/mL ；俄羅斯鯉LC50為104.6414 cfu/mL；鏡鯉LC50為104.5694 cfu /mL ，表明不同品種鯉魚對柱形病的抗病能力存在差異，四種鯉抗病力大小依次為東平湖鯉>建鯉>俄羅斯鯉>鏡鯉，其中東平湖鯉和建鯉無顯著差異，二者和鏡鯉的差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：鯉魚；柱形?。€鰓?。?；抗病力

東平湖鯉（Cyprinus carpio）屬鯉形目、鯉科，源自黃河，和黃河鯉魚同屬一個品種，是東平湖久負(fù)盛名的大型經(jīng)濟(jì)魚類，水汛時黃河鯉隨河水進(jìn)入湖內(nèi)，因湖內(nèi)水質(zhì)肥沃，適宜魚類繁育和生長而在湖內(nèi)定居。相對隔離的生存環(huán)境使得東平湖鯉與黃河鯉等其它水體的鯉魚基因交流較少，形成相對獨(dú)立的地理種群，該魚體型短寬，背蒼黑色，腹黃白色，尾鰭下葉呈紅色，譽(yù)謂“金翅金鱗”，其肉嫩鮮美，肥而不膩，營養(yǎng)極為豐富，為魚中之上品。近年來由于市場需求量的急劇增加，過度捕撈使得東平湖鯉野生資源銳減，近年來湖區(qū)人工增殖放流和民間放生活動的的開展，導(dǎo)致東平湖鯉這一長久以來形成的獨(dú)特地理群體遭受到不同程度的遺傳漸滲，造成基因污染，而一旦污染，這一種質(zhì)資源的原種便再難找到和恢復(fù)，因此有必要對東平湖鯉的種質(zhì)資源進(jìn)行發(fā)掘，以培育生長速度快、抗病抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)良性狀的經(jīng)濟(jì)品系。鯉的地方群體或品系較多，為了比較不同鯉魚對柱形病抗病能力的差異，本文以東平湖鯉、建鯉、俄羅斯鯉及鏡鯉等作為研究對象，通過對柱形病抗病力的差異測定和比較，以期為鯉魚抗病遺傳育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗魚及試驗菌種

東平湖鯉取自東平湖，是用野生東平湖鯉繁育的F1代個體，建鯉購自槐蔭區(qū)養(yǎng)殖場，俄羅斯鯉和鏡鯉取自省淡水漁業(yè)研究院，購買后飼養(yǎng)1個月，以消除養(yǎng)殖環(huán)境因子的影響，暫養(yǎng)期間定期潑灑藥物以防發(fā)生魚病。試驗魚體長11.5～156 cm，體重22.9～38.5 g，試驗菌種為柱狀黃桿菌 （F.columnare），由中科院水生生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 柱狀黃桿菌的培養(yǎng)和記數(shù) 采用含1μg/mL妥普霉素的Shieh培養(yǎng)基培養(yǎng)柱狀黃桿菌，先用固體培養(yǎng)基27 ℃培養(yǎng)，再挑取單克隆接種到4 mL液體培養(yǎng)基27 ℃振蕩培養(yǎng)，18 h 后取1 mL 接種到100 mL中再培養(yǎng)18 h，測其OD600值，并進(jìn)行菌落記數(shù)。分別稀釋101、102、103、104、106五個梯度，各濃度取0.2 mL涂布到固體培養(yǎng)基平板上，各濃度設(shè)3個重復(fù)。27 ℃恒溫培養(yǎng)17 h 后菌落計數(shù)。

1.2.2 攻毒預(yù)試驗 采用菌液浸泡法攻毒，試驗在塑料周轉(zhuǎn)箱中進(jìn)行，每組試驗魚20尾，分別用1×104 cfu/mL、1×105cfu/mL 、1×106 cfu/mL的菌液濃度浸泡1 h 后，轉(zhuǎn)移到盛有清水的塑料箱中觀察，箱內(nèi)保持充氣，試驗水溫26 ℃。

1.2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）的測定 每組試驗用魚20尾，分別用濃度為1×104 cfu/mL、2×104 cfu/mL、4×104 cfu/mL、8×104 cfu/mL、1.6×105 cfu/mL的菌液浸泡攻毒，另外設(shè)置空白對照組。菌液浸泡1 h 后，轉(zhuǎn)移到清水中，每天記錄2次魚的死亡情況，連續(xù)記錄3 d。試驗在塑料周轉(zhuǎn)箱中進(jìn)行，試驗期間保持充氣，試驗水溫26 ℃，半數(shù)致死濃度（LC50）計算方法參考Reed-Muench法[1]。

2 結(jié)果

2.1 柱狀黃桿菌的培養(yǎng)和菌落記數(shù)

取1 mL 培養(yǎng)液接種到100 mL液體培養(yǎng)基中27 ℃振蕩培養(yǎng)18 h后，測得其OD600值后結(jié)合菌落計數(shù)，計算出菌液濃度為2×108cfu/mL。

2.2 預(yù)攻毒試驗

攻毒處理24 h后觀察發(fā)現(xiàn)用1×104 cfu/mL濃度浸泡處理的鯉魚全部存活，而用1×105cfu/mL和 1×106 cfu/mL濃度處理的魚則全部死亡。

2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）的測定結(jié)果

四種鯉魚感染柱狀黃桿菌3 d內(nèi)的死亡情況見表1，計算得出各自的半數(shù)致死濃度（LC50）見表2。試驗結(jié)果的方差分析表明，四種鯉魚中東平湖鯉與建鯉無顯著差異，二者與鏡鯉的差異極顯著（P<001），俄羅斯鯉與鏡鯉也有顯著差異（P<0.05）。

3 討論

東平湖鯉選育的主要目標(biāo)是提高生長速度和增強(qiáng)抗逆抗病能力，本研究選用4種不同品種鯉魚來探討其對柱形病的抗病力差異，其中東平湖鯉是捕自東平湖的野生親本經(jīng)人工繁育的子一代；建鯉為濟(jì)南本地養(yǎng)殖群體，經(jīng)過連續(xù)多代人工繁育的后代；俄羅斯鯉和鏡鯉取自山東省淡水漁業(yè)研究院，引自天津市水產(chǎn)研究所。

柱狀黃桿菌是世界范圍的水生動物致病菌，其宿主范圍極廣泛，可感染鮭科、鯉科、鯰科、鱸科等多個科的魚類，幾乎所有的淡水魚均對該菌敏感，是我國重要養(yǎng)殖魚類草魚、鯉魚等爛鰓病的病原菌[2]，它是條件致病菌，組織損傷、高溫、低氧、操作不當(dāng)及繼發(fā)感染等都有可能發(fā)病，主要危害魚鰓，也可引起體表潰瘍。通過本試驗研究，計算出各自的半致死濃度（LC50），結(jié)果顯示柱狀黃桿菌對四種鯉半致死濃度順序為東平湖鯉>建鯉>俄羅斯鯉>鏡鯉，方差分析表明，東平湖鯉和建鯉差異不顯著，兩者與鏡鯉有極顯著差異（P<0.01）。

本研究結(jié)果為野生東平湖鯉子一代的抗柱形病能力最強(qiáng)，鏡鯉的抗病力最弱，和蔡完其等[3]研究鯉魚對嗜水氣單胞菌的LC50的結(jié)果建鯉>野鯉>鏡鯉及盧彤巖等[4]對高寒鯉和散鱗鏡鯉的比較結(jié)果相似。分析可能有以下幾個方面原因：一是東平湖鯉為野生親本的子一代，其親本是自東平湖采集的7齡以上的天然野生群體，經(jīng)過多年優(yōu)勝劣汰的自然選擇，天然群體中體質(zhì)弱的苗種已經(jīng)遭淘汰，能夠成活下來的都是體質(zhì)比較壯的個體；二是野生群體的親本數(shù)量多，具有較高的遺傳變異度和遺傳多樣性水平，避免了因近親繁殖造成的種質(zhì)退化；德國鏡鯉1984年從德國引進(jìn)我國，具有生長快、耐低溫等特點(diǎn)，但是其抗病力差[5]，是因為體表鱗片少，缺乏第一層防御系統(tǒng)的保護(hù)的原因造成的；建鯉是1996年雜交育成的優(yōu)良品種，具有生長快、適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)[6]，本實驗所用的建鯉是附近養(yǎng)殖者多年人工養(yǎng)殖的，親本數(shù)量相對較少外，又經(jīng)過連續(xù)多代人工繁育，存在一定程度的近交衰退，加之是在人工環(huán)境下養(yǎng)殖，飼料營養(yǎng)因素、養(yǎng)殖水環(huán)境因素、人為管理等因素的不當(dāng)，也會導(dǎo)致群體整體抗病能力的減弱；俄羅斯鯉又名烏克蘭鱗鯉，是大馬哈魚與鯉魚的雜交品種，具有耐低溫、生長快、性成熟晚等特點(diǎn)[7]，1998年引進(jìn)我國，但是引進(jìn)的基礎(chǔ)群體較少，經(jīng)過多代的人工繁育，存在近交衰退的問題，從而使其抗病能力減弱。

通過引進(jìn)野生種質(zhì)，更新親本，提高養(yǎng)殖苗種的遺傳多樣性水平，可能在抗病性狀方面獲得一定的改善，然而近交不一定就帶來衰退，遺傳多樣性高也未必能大幅提高抗病和生長效果，有目的的近交可以在很短的時間內(nèi)將某一目標(biāo)性狀進(jìn)行純化和固定，應(yīng)充分利用好現(xiàn)有的種質(zhì)資源，在保護(hù)好野生種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，針對抗病力、生長速度等指標(biāo)進(jìn)行品系和品種的培育才是遺傳育種工作的關(guān)鍵[8]。

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[7] 王錫榮，王秉利.俄羅斯鯉健康養(yǎng)殖試驗[J].齊魯漁業(yè)，2012，29（10）：13-14

[8] 賈智英，石連玉，孫效文.鯉抗病育種研究進(jìn)展[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2012，21（4）：575-579

（收稿日期：2015-06-25）