王 帥，梁 英

（1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003；2.國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島266061；3.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島266003）

鹽度是影響海洋微藻生長的重要環(huán)境因子，鹽度的高低必然會促進或抑制海洋微藻的生長，直接或間接影響其光合作用和呼吸作用。大量實驗結(jié)果表明［1－4］，鹽度會通過多條途徑來影響植物光合作用，例如：離子脅迫和滲透脅迫，高鹽條件下還會造成水分平衡的紊亂、影響光合電子傳遞效率和CO2同化作用。傳統(tǒng)方法確定微藻生存鹽度和最適生長鹽度范圍是通過比較微藻在不同鹽度條件下的細胞密度，耗時較多［5］。為了解決這一問題，國外某些學者利用植物體內(nèi)葉綠素作為天然探針，在黑暗環(huán)境中適應數(shù)分鐘，然后置于適當?shù)募ぐl(fā)光下，通過檢測植物發(fā)出的隨時間變化的微弱熒光信號（Kautsky效應）來測定微藻對鹽度的適應范圍［6］。

利用葉綠素熒光分析技術(shù)可對植物進行活體測定和診斷，這一方法具有快速、準確和需要樣品量少等優(yōu)點，目前，采用葉綠素熒光分析技術(shù)研究不同鹽度對高等植物光合作用影響的報道相對較多，但由于實驗材料、生長階段和處理時間等因素的不同，研究結(jié)果不太一致。Singh等［7］研究結(jié)果表明鹽脅迫能促進PSII的功能；而Allakhverdiev等［8］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會抑制PSII的功能；Qia等［9］報道鹽脅迫對PSII的功能沒有造成明顯的影響。迄今為止，有關(guān)鹽脅迫對植物葉綠素熒光特性影響已有較多的報道［10－14］，但目前還未見鹽脅迫對高耐鹽藻株—鹽生杜氏藻葉綠素熒光特性影響的報道。

鹽生杜氏藻是綠藻門中唯一一種無細胞壁的單細胞海洋微藻，是高鹽環(huán)境中常見藻株，具有很強的耐鹽性，因其富含胡蘿卜素和甘油而逐漸受到重視，近年來已被國內(nèi)外廣泛應用于環(huán)境脅迫的研究［15］。本文采用Water－PAM葉綠素熒光儀研究不同鹽濃度對1株具有很好的耐受高鹽脅迫特性的鹽生杜氏藻生長及葉綠素熒光特性的影響，以期為篩選耐鹽微藻藻株提供重要的方法，并為揭示鹽生杜氏藻光合作用抵抗鹽脅迫時的響應機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

實驗所用鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）（代號MACC／C43）藻種來源于中國海洋大學藻種庫。

1.2 微藻培養(yǎng)及鹽脅迫處理

培養(yǎng)采用f／2培養(yǎng)基［16］，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強度為100μmol·m－2·s－1，采用連續(xù)光照進行培養(yǎng)。

在250mL的錐形瓶中進行鹽脅迫實驗，將處于指數(shù)生長期的鹽生杜氏藻離心洗滌后，以2.08×104個／mL的接種量分別培養(yǎng)在不同鹽度的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液鹽度設(shè)定為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130等梯度，每個鹽度3個平行組。培養(yǎng)過程中隨機調(diào)換錐形瓶并搖動3次／d。在接種12、24和48h后取樣，測定鹽生杜氏藻的葉綠素熒光參數(shù)、細胞密度和葉綠素含量。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)、葉綠素含量的測定及數(shù)據(jù)處理

按照王帥等［13］的方法，采用 Water－PAM 葉綠素熒光儀進行熒光參數(shù)和葉綠素含量的測定。

采用Origin Pro8.0軟件進行作圖。采用SPSS11.0軟件進行多因子方差分析（鹽度、脅迫時間以及二者的交互作用（鹽度×時間））和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對鹽生杜氏藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

圖1和表1給出了鹽度和脅迫時間對鹽生杜氏藻葉綠素熒光參數(shù)的影響。表1（a）的多因子方差分析結(jié)果表明，在整個培養(yǎng)過程中，鹽度和脅迫時間對鹽生杜氏藻的熒光參數(shù) Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、qP 和NPQ均有顯著影響（P＜0.001），其中鹽度對參數(shù)Fv／Fm、Fv／Fo和 qP 的 影 響 更 顯 著，而 脅 迫 時 間 對rETR和NPQ的影響更顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII和Fv／Fo值在鹽度100時最高，但在鹽度20～110范圍內(nèi)無顯著性差異；rETR值在鹽度為60時達到最高；qP值在鹽度為5時最高；NPQ值則在鹽度為90時最高。脅迫時間對該藻的上述6個熒光參數(shù)值均有顯著影響，各參數(shù)值均隨脅迫時間的延長而逐漸升高。

鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與鹽度之間的相關(guān)性見表2，鹽度在5～70之間的范圍內(nèi)，脅迫12和48h后，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與鹽度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，脅迫48h后qP與鹽度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。NPQ在脅迫12h時與鹽度無明顯的相關(guān)性，在脅迫24和48h時，該參數(shù)與鹽度呈極顯著正相關(guān)；鹽度在70～130范圍內(nèi)時，熒光參數(shù)Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR 以及qP均與鹽度呈極顯著的負相關(guān)性；脅迫12h后，NPQ與鹽度呈顯著的負相關(guān)；脅迫24h后，NPQ與鹽度呈極顯著的負相關(guān)；脅迫48h后與鹽度無明顯的相關(guān)性。

圖1 鹽度對鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細胞密度和葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of salinity on the fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content of D.salina

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表2 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細胞密度及葉綠素含量與鹽度的相關(guān)系數(shù)Table 2 The interrelated coefficients of fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content with salinity of D.salina

2.2 鹽度對鹽生杜氏藻細胞密度和葉綠素含量的影響

圖1和表1給出了鹽度和脅迫時間對鹽生杜氏藻細胞密度和葉綠素含量的影響。表1（a）的多因子方差分析表明，在整個培養(yǎng)過程中，鹽度、脅迫時間及其交互作用對該藻的葉綠素含量和細胞密度均產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.001），脅迫時間對上述2個參數(shù)的影響最為顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，鹽度在5～100之間的范圍內(nèi)，48h后隨著鹽度的升高，細胞密度和葉綠素含量的值明顯增加，且均在鹽度100時達到最大值；鹽度在100～130之間時，上述2個參數(shù)的值隨鹽度升高而逐漸降低。鹽生杜氏藻的細胞密度和葉綠素含量數(shù)值均隨脅迫時間的延長而逐漸增加。

表3給出的鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與細胞密度之間的相關(guān)關(guān)系，由表3可見，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與細胞密度呈極顯著的正相關(guān)；脅迫12和24h后，qP和NPQ與細胞密度的相關(guān)性較差，qP和NPQ在脅迫48h后與細胞密度呈顯著的正相關(guān)性。

表3 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)及葉綠素含量與細胞密度的相關(guān)系數(shù)Table 3 The interrelated coefficient of fluorescence parameters and chlorophyll content with cell density of D.salina

3 討論

作為一種研究植物光合功能的新型植物活體檢測和診斷技術(shù)，葉綠素熒光分析技術(shù)在測定植物光合作用的過程中，利用植物中葉綠素作為天然探針，在光能的吸收、傳遞、分配和耗散等方面具有獨特的優(yōu)勢，并且其快速、靈敏、不會對細胞造成損傷。國際上對葉綠素熒光分析技術(shù)的研究已成為熱點，并針對耐寒性、耐熱性、耐強光性和耐鹽性等多種逆境生理條件進行了研究，結(jié)果表明，葉綠素熒光技術(shù)在研究植物逆境生理方面有許多優(yōu)勢［17－19］，但有關(guān)鹽脅迫對微藻光合作用影響的研究不多［12－13，20－22］。Fv／Fm比值是 PSII最大光化學量子產(chǎn)量，可以反映PSII的活性大小。正常生理狀態(tài)下參數(shù)Fv／Fm很穩(wěn)定，浮游植物Fv／Fm值保持在0.65左右［23］，該參數(shù)不具有種間特異性，但植物受到脅迫后，F(xiàn)v／Fm值會明顯降低。有研究結(jié)果表明，微藻在鹽脅迫條件下，其PSII的活性會降低，反映在Fv／Fm會隨鹽度的增加而下降。畢永紅等［20］研究發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中NaCl濃度的增加，發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）Fv／Fm比值逐漸降低，歐陽葉新等［21］對魚腥藻（Anabaenasp.）的研究也得到了相似的結(jié)果。而陳蘭周等［22］的實驗表明，爪哇偽枝藻（Scytonema javanicum）對鹽脅迫則很敏感，在0.1mol／L NaCl時Fv／Fm比值已下降至0.4左右。本實驗結(jié)果表明，鹽生杜氏藻有很強的耐鹽性，適宜鹽度范圍為20～110，在此鹽度范圍之間，F(xiàn)v／Fm比值無明顯降低，當?shù)望}脅迫（鹽度＜20）和高鹽脅迫（鹽度＞110）條件下，F(xiàn)v／Fm比值才開始逐漸降低。鹽脅迫條件下，鹽生杜氏藻的PSII熒光指標Fv／Fo、rETR 與Fv／Fm具有相同 的 變 化 趨勢，可見鹽生杜氏藻自身光系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換能力較強。ΦPSII的變化，反映的是藻細胞同化力（NADPH，ATP）的形成，即碳的固定與同化作用，本實驗研究結(jié)果表明，在鹽度20～110之間，不影響鹽生杜氏藻對CO2的固定和同化。qP（光化學淬滅）的變化表明，吸收的光能用于電子傳遞，當qP降低時表示進行光合作用的電子正在減少，以熱的形式耗散的光能會逐漸增加，這與NPQ（非光化學淬滅）的變化是吻合的。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對熒光指標（qP和NPQ）都造成了一定程度的抑制作用。

有關(guān)微藻耐鹽機制的研究，主要集中在光合色素和蛋白含量等方面。Rafiqul［24］等研究發(fā)現(xiàn)，藍藻（Spirulina fusiformis）葉綠素a含量隨著NaCl濃度的增加而降低。藍藻（S.fusiformis）在較低NaCl濃度條件下，類胡蘿卜素含量降低；而在較高NaCl濃度條件下，其類胡蘿卜素含量增加。耐鹽藍藻（Anabaena doliolum）的葉綠素含量則隨著NaCl濃度的增加而增加［7］。鹽脅迫下，藻藍蛋白（PC）含量的變化結(jié)果較為一致，集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803在鹽處理下，PC含量明顯降低［25］；藍藻（S.fusiformis）的 PC含量隨鹽濃度的增加而降低［24］。本實驗結(jié)果表明，在鹽度為20～110條件下，鹽脅迫不僅不會對耐鹽的鹽生杜氏藻造成損傷，反而會促進其生長，48h后隨著鹽度的升高，細胞密度和葉綠素含量逐漸增加，鹽度為100時，二者均達到最大值。但超過一定鹽度范圍（＞110）后，高鹽脅迫對鹽生杜氏藻的PSII會產(chǎn)生傷害，主要表現(xiàn)在加速了藻體中葉綠素含量的降低（見圖1），可能高鹽（＞110）會影響類囊體膜的穩(wěn)定性，加速葉綠素的分解，從而降低PSII反應中心的光合速率。目前對于微藻耐鹽機制的研究還不是十分清楚，僅從某一方面研究其耐鹽性還遠遠不夠，這有待于進行深入研究。

鹽生杜氏藻屬于水產(chǎn)動物的優(yōu)質(zhì)餌料之一，但可能由于微藻藻株、培養(yǎng)條件等因素的不同，目前對鹽生杜氏藻適鹽范圍的報道并不一致。吳春［26］報道鹽生杜氏藻（D.salina）的最適鹽度范圍為20～30。而呂愛玲等［27］對中國渤海灣灘涂的綠色杜氏藻進行鹽度馴化實驗，認為綠色杜氏藻可在9～320的鹽度范圍生長，能耐受接近飽和的鹽度條件。本文的研究結(jié)果表明，鹽生杜氏藻對鹽度的適應范圍很廣，在鹽度20～110時，F(xiàn)v／Fm值無顯著性差異，這表明鹽度20～110均適于鹽生杜氏藻的生長，與之前利用葉綠素熒光技術(shù)對塔胞藻［13］的研究結(jié)果相比，本研究篩選得到的這株鹽生杜氏藻（D.salina）具有更好的耐鹽性，在高鹽條件下更有利于對其進行培養(yǎng)。即使鹽度在5～20之間的低鹽脅迫條件下，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、細胞密度和葉綠素含量等一系列指標均在逐漸增加（見圖1），這也是該藻株對鹽度較強適應性的一種表現(xiàn)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽生杜氏藻在鹽度5～110之間均能生長，最適鹽度為100。本文的結(jié)果表明，鹽生杜氏藻PSII的熒光指標（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細胞密度均呈極顯著的正相關(guān)性，而且細胞密度也與葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)性，因此，在一定范圍內(nèi)，可通過該藻PSII熒光指標的變化反映其細胞密度及葉綠素含量對鹽脅迫的耐受性。與計數(shù)細胞密度的傳統(tǒng)方法相比，葉綠素熒光分析方法更加快速、靈敏和準確，并且不會對藻細胞造成損傷［28－29］。

現(xiàn)已證明，PSII的熒光指標更能反映植物的內(nèi)在性特點，因此，葉綠素熒光技術(shù)已成為篩選高等植物（擬南芥、枸杞，特別是小麥等）耐鹽品種的一種理想手段［1，4，14］。本文的結(jié)果表明，篩選得到的鹽生杜氏藻其耐鹽性很好，該藻 PSII的熒光指標（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細胞密度具有良好的正相關(guān)關(guān)系，可用于該藻鹽脅迫耐受性的評價依據(jù)，但目前對這方面研究的微藻品種還較少，PSII的熒光指標作為篩選耐鹽微藻的參考指標是否可行，有待針對不同的微藻品種和品系進行全面的實驗研究，以確定該方法的適應范圍及可靠性。

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