田亞平， 陳 洋， 于 雷， 侯東軍， 曹忠君， 姜艷彬*

(1.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102609; 2.鐵嶺市畜產(chǎn)品安全檢測站，遼寧鐵嶺 112000)

喹諾酮類藥物是一類人工合成的具有4-喹諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，因其具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、吸收快、體內(nèi)分布廣泛、不良反應(yīng)小，以與其他抗菌藥無交叉耐藥性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)物各類感染[1，2]。目前，獸用中藥制劑中存在非法大量添加抗生素、抗病毒藥等化學(xué)藥品，喹諾酮類藥物就是其中的一種，這不僅易造成動(dòng)物源性食品中藥物殘留，且給人們身體健康造成巨大傷害[3]。

目前，喹諾酮類藥物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[4-9]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合UPLC的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)勢，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，可以獲得豐富、有效的化合物結(jié)構(gòu)信息，建立快速、高效的分析研究體系[10]。本方法旨在建立一種快速簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的UPLC-MS/MS方法，用以測定獸用中藥散劑中喹諾酮類藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜-Quattro premier XE質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司)；AE260電子天平(Mettler Toledo公司)；Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技)；Organomation Associates氮吹儀(Jnc公司)；VORTEX 1漩渦混合器(IKA公司)；MassLynx v 4.1數(shù)據(jù)處理軟件(Waters公司)；HLB小柱(3 cc，HLB；Waters公司)。

培氟沙星(Pefloxacin)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、恩諾沙星(Enrofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、伊諾沙星(Enoxacin)、吡哌酸(Pipemidic Acid)、萘啶酸(Nalidixic Acid)、西諾沙星(Cinoxacin)、諾氟沙星(Norfloxacin)、達(dá)氟沙星(Danofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、二氟沙星(Difloxacin)、沙氟沙星(Sarafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)14種對照品，純度均大于98.0%(Dr．Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Fisher公司)；三氯乙酸為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取14種喹諾酮類藥物對照品0.0100 g，甲醇溶解，并定容于100 mL容量瓶中，配制成100.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得1.00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 供試品

陰性樣品：止痢散(愛德森(北京)生物科技有限公司)；四味穿心蓮散(江蘇省徐州仙潮藥業(yè)有限公司)。以上兩種中獸藥散劑均購買于合格廠家，經(jīng)檢測不含喹諾酮類藥物。

陽性添加散劑：按照0.5%、1.0%和2.0%的比例在陰性對照散劑中添加14種喹諾酮對照品，混勻。

1.4 樣品前處理

稱取中藥散劑1.0 g，加水10.0 mL，超聲溶解。HLB柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，待溶液流至填料上層以下，加5.0 mL樣品提取液至HLB柱中，控制流速小于3 mL/min，然后用3 mL水淋洗，抽干，3.0 mL甲醇洗脫，將洗脫液于30 ℃下氮?dú)獯蹈?。殘余物用初始流?dòng)相2.0 mL溶解，渦旋混勻，以10 000 r·min-1的速率高速離心10 min。取適量上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～10.0 min，3.0%～90.0%A；10.0～10.1 min，90.0%～3.0%A；10.1～13.0 min，3.0%A；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；錐孔電壓為3.0 V；RF透鏡電壓為0.5 V；離子源的溫度為110 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣流速為650 L·h-1；錐孔反吹氣流速為50 L·h-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為了提高分析的靈敏度和專一性，選用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測，并同時(shí)進(jìn)行定性和定量的雙離子通道分析，進(jìn)一步提高該方法的準(zhǔn)確性和專屬性。喹諾酮類藥物定性和定量離子對列于表 1。

為了提高方法的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多時(shí)間段的MRM(mpMRM)，即按照待測藥物的保留時(shí)間，分為多個(gè)時(shí)間段分別進(jìn)行MRM掃描，具體測定條件見表1。mpMRM數(shù)據(jù)采集模式在一個(gè)循環(huán)中檢測多個(gè)藥物，節(jié)約分析時(shí)間，尤其是mpMRM靈敏度高，能夠檢測含量較低的待測組分。

表1 14種喹諾酮類藥物的保留時(shí)間、定性和定量離子對及MRM參數(shù)Table 1 Retention time,quantitative and qualitativeion-pair,and MRM parameters of 14 quinolone drug

(續(xù)表1)

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1專屬性陰性樣品中添加14種喹諾酮類藥物(10.0 μg·mL-1)，并按照前處理方法進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，14種喹諾酮類藥物能和中藥散劑中的其他物質(zhì)完全分離，沒有干擾。

2.2.2線性關(guān)系和檢測限準(zhǔn)確吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1的系列空白添加試樣，然后進(jìn)行UPLC-MS/MS測定。以各藥物定量離子的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，樣品濃度(X，ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算檢出限(LOD,S/N>3)和定量限(LOQ,S/N>10)，結(jié)果見表2。可以看出14種喹諾酮類藥物在1.5～200.0 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.990。

表2 14種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢測限Table 2 Calibration curves，correlation coefficients,LODs and LOQs of 14 quinolone drug

2.2.3精密度和回收率按照高(2.0%)、中(1.0%)、低(0.5%)3個(gè)不同比例，添加14種喹諾酮類藥物混合溶液到陰性中藥散劑中，每個(gè)濃度測定6個(gè)樣本，按照1.4處理樣品，與對照品平行進(jìn)樣分析，用外標(biāo)法定量，本實(shí)驗(yàn)的回收率為95.1%～106.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～4.8%。結(jié)果表明各樣本回收率和精密度符合分析要求。

2.3 實(shí)際獸用中藥散劑的分析

在市場中隨機(jī)購買獸藥20份，用建立的方法對樣品中的喹諾酮類藥物進(jìn)行檢測，結(jié)果在20份樣品中，發(fā)現(xiàn)1份名為“病毒靈”的獸用中藥散劑中含有恩諾沙星和諾氟沙星，進(jìn)一步表明本研究所建立的方法有效，能夠檢測到獸用中藥散劑中的喹諾酮類藥物，且有一定的實(shí)用性。

3 結(jié)論

本文采用UPLC-MS/MS法同時(shí)測定獸用中藥散劑中14種喹諾酮類藥物。該方法中質(zhì)譜掃描采用mpMRM模式，從而顯著提高檢測靈敏度，適合對獸用中藥散劑中的喹諾酮類藥物進(jìn)行測定。本研究對市場購買的樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)1份陽性樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的有效性和實(shí)用性。