朱敏俠， 戎 浩， 劉曉麗， 王世華， 孫芳云， 李 楊

（西藏民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西　咸陽　712082）

七十味珍珠丸對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的改善作用

朱敏俠， 戎 浩， 劉曉麗， 王世華， 孫芳云， 李 楊

（西藏民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712082）

目的 觀察七十味珍珠丸對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫的改善作用及其分子機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、溶媒對照組和藥物組。七十味珍珠丸每日灌胃1次，預(yù)給藥7 d后采用大腦中動脈阻塞模型，缺血40 min再灌注24 h，腦含水量測定評估腦水腫程度，Western blot法檢測大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦水腫明顯，AQP4蛋白表達(dá)明顯升高；而與模型組比較，藥物組大鼠腦水腫明顯改善，AQP4蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論 七十味珍珠丸可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫及AQP4蛋白表達(dá)。

七十味珍珠丸；腦缺血再灌注損傷；腦水腫；水通道蛋白4

腦卒中是危害中老年人身體健康和生命的主要疾病之一，在2008年衛(wèi)生部公布的第3次全國死因調(diào)查中顯示，腦卒中已超過惡性腫瘤成為中國第一致死病因，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。腦卒中包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，缺血性腦卒中約占87%，其發(fā)病原因在于腦的主要供血?jiǎng)用}狹窄或閉塞，疾病發(fā)展過程中或后期治療時(shí)局部閉塞的血管再通，從而發(fā)生腦缺血再灌注損傷［2］。

藏藥七十味珍珠丸（藏文譯音為然納桑培Rannasangpei，簡稱RNSP），主要由佐太、天然珍珠、天然牛黃、羚羊角、麝香、藏紅花等七十余味名貴藏藥組成，具有安神、鎮(zhèn)靜、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血、醒腦開竅的作用，在腦溢血、腦栓塞、高血壓、癲癇、腦卒中等疾病中廣為應(yīng)用［3-4］。七十味珍珠丸對腦缺血保護(hù)作用的研究結(jié)果顯示該藥對大腦動脈血栓引起的局部缺血所致的行為障礙有改善作用，減少了腦梗死面積以及腦組織的病理學(xué)改變，說明該藥對腦缺血有保護(hù)作用［5］。本研究擬通過觀察七十味珍珠丸對腦水腫的改善作用及分子機(jī)制，進(jìn)一步探討該藥對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料

1.1動物 44只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠（200±20）g，SPF級，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2藥物和試劑 七十味珍珠丸（西藏自治區(qū)藏藥廠，國藥準(zhǔn)字Z54020062）。兔抗大鼠水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）抗體（1∶1 000；美國Santa Cruz公司）、小鼠抗大鼠β-actin抗體（1∶5 000；美國Millipore公司）、HRP標(biāo)記抗兔抗體（1∶1 000；美國Millipore公司）和HRP標(biāo)記抗小鼠抗體（1∶1 000；美國Millipore公司）。

1.3耗材與儀器 大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型栓線-AAAA級（北京沙東生物技術(shù)有限公司）；蛋白質(zhì)印跡法全套設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司）；凝膠分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

2　方法

2.1動物預(yù)處理給藥 大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（sham）、模型組（MCAO）、溶媒對照組（vehicle+ MCAO）和七十味珍珠丸藥物組，簡稱藥物組（RNSP+ MCAO）。將七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸餾水稀釋（終質(zhì)量濃度0.1 kg/L），藥物組以1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，溶媒對照組以蒸餾水灌胃，最后一次灌胃后1 h制作模型。

2.2局灶性腦缺血再灌注模型的制備 MCAO模型是模擬缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的首選模型［6］。6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位，頸部剪毛，常規(guī)消毒皮膚后，參照Longa線栓法［7］并加以改進(jìn)制備大鼠右側(cè)MCAO模型，先分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈和翼顎動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，近心端穿線打一松結(jié)，血管夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動脈和翼顎動脈，在頸外動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎線和近心端松結(jié)之間剪一小口將栓線插入頸總動脈，拉緊松結(jié)的線并將遠(yuǎn)心端剪斷，頸外動脈向頸總動脈方向拉直，經(jīng)頸內(nèi)動脈插入栓線，插入長度約18 mm（自頸總動脈分叉處算起），再灌注時(shí)拔出栓線并結(jié)扎頸外動脈斷端。假手術(shù)組插入栓線0.5～1 mm，其余操作同模型組。本課題選用缺血40 min再灌注24 h的時(shí)間點(diǎn)，再灌注結(jié)束后參照Longa評分法［7］進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分，1～3分者入選后繼實(shí)驗(yàn)。

2.3腦含水量測定 大鼠麻醉斷頭取腦，將左右大腦半球分開，分別放在電子天平上稱濕質(zhì)量，記錄。然后置于100℃烘箱中烘烤72 h，稱干質(zhì)量，按照公式計(jì)算腦含水量：（腦濕質(zhì)量-腦干質(zhì)量）/腦濕質(zhì)量×100%。各組數(shù)據(jù)錄入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot） 取大鼠右側(cè)海馬組織稱定質(zhì)量，加入裂解液勻漿提取上清，測量蛋白濃度，加入等體積2×loading buffer后煮沸5 min作變性處理，然后上樣跑電泳。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于封閉液中室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min，洗3次，ECL顯影液加于膜上反應(yīng)2 min，在凝膠成像系統(tǒng)中選擇合適的曝光時(shí)間進(jìn)行顯影，圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并保存數(shù)據(jù)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均以SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1七十味珍珠丸降低腦含水量 腦缺血再灌注24 h，通過測量腦組織含水量來判斷腦水腫情況，缺血側(cè)大腦半球檢測結(jié)果表明：與假手術(shù)組（78.53±0.45）%比，模型組（81.95±0.63）%腦含水量明顯增加（P＜0.01）；而與模型組比，藥物組（79.16±0.38）%腦含水量減少（P＜0.05）。缺血對側(cè)大腦半球腦含水量在各組間沒有明顯變化，結(jié)果見表1。

表1　缺血對側(cè)和缺血側(cè)大腦半球腦含水量變化（±s，n=6）

表1　缺血對側(cè)和缺血側(cè)大腦半球腦含水量變化（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與溶媒對照組比較，△△P＜0.01

組別缺血對側(cè)大腦半球/%缺血側(cè)大腦半球/%假手術(shù)組78.09±0.28 78.53±0.45模型組78.06±0.27 81.95±0.63**溶媒對照組78.41±0.67 82.2±1.13**藥物組78.06±0.33 79.16±0.38#△△

3.2七十味珍珠丸減少海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá) 腦缺血再灌注24 h，Western blot檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與假手術(shù)組比，模型組（1.25±0.02，P＜0.01）AQP4蛋白表達(dá)明顯升高；與模型組比，藥物組（1.08±0.04，P＜0.01）AQP4蛋白表達(dá)下降，結(jié)果見圖1。

4　討論

水通道蛋白是一個(gè)水選擇性通道蛋白家族，目前已從哺乳類動物鑒定出13種水通道蛋白亞型（AQP0-AQP12），它們分布在不同的組織中［8］。AQP4單體分子質(zhì)量為28 kDa，有1個(gè)由6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的水孔，在腦內(nèi)分布廣泛，包括小腦、海馬齒狀回、海馬CA1-CA3區(qū)、下丘腦視神經(jīng)上核和室旁核、新皮層、終紋核和韁核等［9］，而且主要表達(dá)在血-腦屏障、血-腦脊液屏障及滲透壓感受器的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上，這種分布特點(diǎn)提示它與腦內(nèi)的水平衡調(diào)節(jié)存在密切關(guān)系，是控制腦實(shí)質(zhì)內(nèi)外水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要信號分子［10-11］。

圖1　七十味珍珠丸減少M(fèi)CAO組大鼠海馬CA1區(qū)AQP4蛋白表達(dá)（n=5，±s）

腦水腫分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，前者是由細(xì)胞代謝紊亂導(dǎo)致，后者是由血-腦屏障功能障礙及生物大分子降解導(dǎo)致［12］。AQP4在細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫的病理生理機(jī)制中非常重要，在細(xì)胞毒性腦水腫中，AQP4促進(jìn)水腫形成，在血管源性腦水腫中，AQP4促進(jìn)水腫消散［13-15］。大鼠局灶性腦缺血模型可造成細(xì)胞毒性腦水腫，造模后24 h，AQP4表達(dá)上調(diào)并直至造模后第7天，第3天上調(diào)最明顯，AQP4不僅在缺血中心區(qū)表達(dá)增多，在缺血周邊區(qū)域也表達(dá)增多，它的增多和腦水腫呈一致性［12，16］，而AQP4敲基因小鼠在腦缺血24 h后的腦水腫減輕、缺血面積和神經(jīng)缺失體征減少［13］，以上資料表明AQP4是局灶性腦缺血模型造模后參與腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要水通道蛋白。也有臨床報(bào)道，在腦梗死病人的大腦中，缺血中心區(qū)和邊緣區(qū)AQP4表達(dá)均上調(diào)［17］。

本課題研究結(jié)果顯示，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織水腫明顯，AQP4蛋白表達(dá)增高，與模型組比，七十味珍珠丸藥物組腦水腫明顯減輕，AQP4蛋白表達(dá)下降。本研究再次證實(shí)了AQP4參與了腦缺血再灌注損傷過程中腦水腫的形成，而七十味珍珠丸預(yù)給藥可明顯減輕腦水腫，減少AQP4蛋白表達(dá)，從而對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，也為臨床上預(yù)防治療缺血性腦卒中提供了理論依據(jù)。

［1］ 王隴德.中國腦卒中防控要有戰(zhàn)略與戰(zhàn)術(shù)［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（2）：1-2.

［2］ Gouriou Y，Demaurex N，Bijlenga P，et al.Mitochondrial cal-cium handling during ischemia-induced cell death in neurons［J］.Biochimie，2011，93（12）：2060-2067.

［3］ 蔣慶鋒.藏藥七十味珍珠丸藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（36）：17-18.

［4］ 杜文兵，黃福開，邵 杰，等.七十味珍珠丸藥理及臨床研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：367-371.

［5］ 陳秋紅，海 平，都 渝，等.藏藥七十味珍珠丸對大鼠缺血性腦梗塞作用的研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2001，7（1）：33-34.

［6］ Carmichael S T.Rodentmodels of focal stroke：size，mechanism，and purpose［J］.Neuro Rx，2005，2（3）：396-409.

［7］ Longa E Z，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［8］ Verkman A S.More than justwater channels：unexpected cellular roles of aquaporins［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 15）：3225-3232.

［9］ Jung JS，Bhat R V，Preston G M，et al.Molecular characterization of an aquaporin cDNA from brain：candidate osmoreceptor and regulator of water balance［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91（26）：13052-13056.

［10］ Saadoun S，PapadopoulosM C.Aquaporin-4 in brain and spinal cord oedema［J］.Neuroscience，2010，168（4）：1036-1046.

［11］ Venero JL，Vizuete M L，Ilundain A A，et al.Detailed localization of aquaporin-4 messenger RNA in the CNS：preferential expression in periventricular organs［J］.Neuroscience，1999，94（1）：239-250.

［12］ Taniguchi M，Yamashita T，Kumura E，et al.Induction of aquaporin-4 water channel mRNA after focal cerebral ischemia in rat［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，78（1-2）：131-137.

［13］ Manley G T，F(xiàn)ujimura M，Ma T，etal.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke［J］.Nat Med，2000，6（2）：159-163.

［14］ Papadopoulos M C，Manley G T，Krishna S，et al.Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema［J］.FASEB J，2004，18（11）：1291-1293.

［15］ Bloch O，Papadopoulos M C，Manley G T，et al.Aquaporin-4 gene deletion in mice increases focal edema associated with staphylococcal brain abscess［J］.J Neurochem，2005，95（1）：254-262.

［16］ Yang M，Gao F，Liu H，et al.Temporal changes in expression of aquaporin-3，-4，-5 and-8 in rat brains after permanent focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，2009，1290：121-132.

［17］ Aoki K，Uchihara T，Tsuchiya K，et al.Enhanced expression of aquaporin 4 in human brain with infarction［J］.Acta Neuropathol，2003，106（2）：121-124.

R285.5

B

1001-1528（2015）03-0640-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.040

2014-05-10

西藏自治區(qū)科技廳資助項(xiàng)目（2010）；西藏民族學(xué)院校級資助科研項(xiàng)目（10myY07）

朱敏俠（1982—），女，博士，講師，主要從事腦缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的研究。Tel：（029）33755247，E-mail：zhuminxia2001@163.com