楊佳等
摘要:發(fā)菜是一種具有豐富膠質(zhì)鞘、色素、多糖的陸生藍藻。采用Omega RNA提取試劑盒、Trizol RNA提取法、天根試劑盒及優(yōu)化后的Omega RNA提取試劑盒、Trizol法、天根試劑盒法從發(fā)菜藻體中提取RNA,并用核酸濃度測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明,優(yōu)化前后的Trizol法均無法提取到發(fā)菜總RNA;利用Omega試劑盒獲得發(fā)菜總RNA已降解;利用天根試劑盒可獲得發(fā)菜總RNA,進一步改進和優(yōu)化天根試劑盒的提取程序,獲得的發(fā)菜總RNA 23S、16S條帶清晰,D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分別為2.06、2.08。研究結(jié)果為深入開展發(fā)菜轉(zhuǎn)錄組研究奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:發(fā)菜;總RNA;提??;方法優(yōu)化
中圖分類號:Q781文獻標志碼:A文章編號:1002-1302(2015)09-0058-03
收稿日期:2014-08-22
基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:31360054)。
簡介作者:楊佳(1988—),女,山東菏澤人,碩士研究生,主要從事資源植物學(xué)方面的研究。E-mail:yangjia713@126.com。
通信作者:梁文裕,博士,教授,主要從事植物資源及植物分子生物學(xué)的研究。E-mail:liangwy2009@163.com。生物體性狀和對外界環(huán)境的響應(yīng)歸根到底是由基因調(diào)控的,基因調(diào)控主要涉及到核酸、蛋白質(zhì)等生物分子,高質(zhì)量RNA是進行基因表達分析的基礎(chǔ)。細胞內(nèi)RNA分子多樣性和易被降解的特性決定了RNA提取過程的復(fù)雜性[1],RNA酶高穩(wěn)定性是造成RNA分離困難的主要原因。RNA提取過程中出現(xiàn)的RNA酶有2種來源:外源性RNA酶和內(nèi)源性RNA酶。外源RNA來自RNA制備過程中用到的玻璃和塑料制品、研究人員本身以及分離過程中用到的試劑或溶液,但這些外源性RNA酶可以通過RNA酶抑制劑處理或使用RNA研究的專用試劑等措施來解決[2-4]。而內(nèi)源性RNA酶存在于材料本身,如材料的不新鮮會降低RNA的產(chǎn)量,破碎細胞內(nèi)含物常與RNA形成難溶的物質(zhì)(多糖類等)導(dǎo)致RNA分離困難[5-6],因此,諸多因素會直接影響RNA的提取效果,增加RNA的提取難度。
發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)是一種陸生固氮藍藻,生長在干旱-半干旱荒漠草原地區(qū),具有獨特的抗干旱、高溫、高光照度、紫外線等非生物脅迫的特性[7]。RNA提取是探索發(fā)菜抗逆差異基因表達或轉(zhuǎn)錄組研究的重要基礎(chǔ),但由于發(fā)菜藻體被較厚的膠質(zhì)鞘包被,對發(fā)菜藻體和細胞的破碎存在一定難度,同時發(fā)菜藻體富含的多糖、色素、蛋白質(zhì)等會以不同方式干擾RNA的提取,從而加大了發(fā)菜藻體RNA提取的難度。目前,國內(nèi)尚無發(fā)菜高質(zhì)量RNA提取的相關(guān)報道,找到適合提取發(fā)菜總RNA的方法具有重要意義。本研究對3種發(fā)菜藻體RNA的提取方法進行比較和優(yōu)化,篩選出最適合發(fā)菜RNA的提取方法,為從抗逆差異基因表達或轉(zhuǎn)錄組角度研究發(fā)菜耐干旱、抗紫外輻射等機理奠定重要基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
野生新鮮發(fā)菜采自寧夏賀蘭山發(fā)菜自然生長地。
1.2發(fā)菜藻體總RNA的提取及優(yōu)化
1.2.1Omega試劑盒法提取發(fā)菜藻體總RNA將研磨充分的發(fā)菜藻體粉末轉(zhuǎn)入Buffer RCL中(含β-巰基乙醇),迅速渦旋振蕩,使材料充分裂解,按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit試劑盒說明書中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ進行試驗。
1.2.2Trizol法提取發(fā)菜藻體總RNA按照TRIzol Reagent說明書進行發(fā)菜藻體RNA的提取。
1.2.3天根試劑盒法提取發(fā)菜RNA將充分研磨至粉末的發(fā)菜藻體迅速轉(zhuǎn)移至裂解液SL(含β-巰基乙醇)中,立即渦旋劇烈振蕩混勻,按天根公司RNAprep Pure Plant Kit試劑盒步驟提取發(fā)菜藻體總RNA。
1.3發(fā)菜藻體總RNA提取方法的優(yōu)化
1.3.1Omega試劑盒方法的優(yōu)化參照Omega試劑盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL進行材料的裂解。試驗步驟中增加DNase I,即當RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后,加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上,10 000 g離心1 min,把配好的DNase Ⅰ mix準確地加入柱子中心,室溫靜置15 min;將HiBindTM RNA Mini柱子放入1個新的收集管中,加400 μL RWC Wash Buffer,靜置5 min,10 000 g離心 1 min;最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水進行RNA的提取。
1.3.2改良Trizol法提取發(fā)菜RNA對TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的發(fā)菜細胞中加入1 mL Trizol 后,用渦旋混合器充分混勻,并在冰上放置15 min;55~60 ℃水孵育10~15 min后,4 ℃放置1 h再轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用。
1.3.3天根試劑盒方法的優(yōu)化參照天根試劑盒法稍作修改。將研磨好的材料加入裂解液SL充分渦旋振蕩混勻后,12 000 g 離心3 min;2次加入去蛋白液RW1后,放置1 min再進行離心1 min;用漂洗液RW漂洗3次再空轉(zhuǎn)離心2 min;加入RNase-Free水后于室溫放置5 min后離心收集RNA。
1.4RNA質(zhì)量和完整性檢測
1.4.1瓊脂糖凝膠電泳檢測分別取RNA樣品進行1.0%的瓊脂糖凝膠,電泳條件為0.5×TAE緩沖液、160 V恒壓、15 min,紫外燈下觀察RNA條帶并照相記錄結(jié)果。
1.4.2RNA產(chǎn)量和純度檢測RNA產(chǎn)量和純度通過核酸濃度測定儀進行檢測。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8~2.2之間,D260 nm/D230 nm比值在2.0左右,說明RNA純度較高,D260 nm/D280 nm比值為2.0時質(zhì)量最高[8]。用RNase free ddH2O作為空白對照,取1 μL RNA樣品,用核酸濃度測定儀檢測D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的濃度(ng/μL)值。
2結(jié)果與分析
2.13種方法提取發(fā)菜總RNA質(zhì)量比較
Omega試劑盒法提取的發(fā)菜總RNA樣品電泳顯示無典型的RNA條帶(圖1);Trizol法所提RNA無23S、16S條帶,只有1條條帶,表明RNA完全降解(圖2);天根試劑盒法提取的發(fā)菜總RNA電泳結(jié)果表明,23S、16S條帶明顯,但條帶拖尾現(xiàn)象嚴重(圖3)。
用核酸濃度測定儀分別檢測3種方法所提發(fā)菜藻體RNA的產(chǎn)量和純度,檢測結(jié)果表明,Omega試劑盒所測值均超出了正常值的范圍;Trizol法所提RNA相關(guān)數(shù)據(jù)遠遠低于正常值范圍,RNA濃度值較高,說明所提RNA不純,蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染嚴重;天根試劑盒法所得數(shù)值均正常,且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0,說明RNA純度較高,可進行優(yōu)化后用于后續(xù)的分子試驗(表1)。
2.23種方法優(yōu)化后所提發(fā)菜藻體RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測
優(yōu)化后Omega試劑盒法所提發(fā)菜總RNA(圖4)與優(yōu)化表1不同方法所提發(fā)菜藻體RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量檢測
方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA濃度
(ng/μL)峰值波長
(nm)Omega試劑盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根試劑盒法2.071.9397.1260
前(圖1)無明顯差異,用DNase處理后,仍有雜帶,無明顯改變,在最下1條亮帶以上,能清晰看到4條條帶,這與正常RNA電泳條帶相異,推測Omega試劑盒不適合發(fā)菜藻體RNA的提?。桓牧己蟮腡rizol法23S、16S 2條帶已有大部分降解,5S條帶比較明亮,并伴有拖尾現(xiàn)象,表明該方法所提RNA降解快,不適合進行后續(xù)試驗(圖5);優(yōu)化后的天根試劑盒法所提發(fā)菜總RNA質(zhì)量有明顯提高,23S、16S條帶清晰,無明顯彌散、拖尾現(xiàn)象(圖6)。
與沒有優(yōu)化前的3種RNA提取方法相比,優(yōu)化的Omega試劑盒法和改良Trizol法所提RNA并沒有提高其質(zhì)量和純度,優(yōu)化的Omega試劑盒法比值依然較高;改良Trizol法所得比值均低,說明改良后Trizol法所提RNA仍伴有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的污染;天根試劑盒經(jīng)過優(yōu)化,所提取的RNA質(zhì)量和濃度都有所增加,D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm、濃度分別達2.06、2.08、154.3 ng/μL(表2),260 nm處峰值顯著(圖7)。
表2不同方法優(yōu)化后所提發(fā)菜藻體RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量檢測
方法D260 nm/
D280 nmD260 nm/
D230 nmC
(ng/μL)峰值波長
(nm)優(yōu)化Omega試劑盒法2.122.24663.1260改良Trizol法1.770.5845.5220優(yōu)化天根試劑盒法2.062.08154.3260
3討論
RNA提取一般采用研磨等方法使細胞破碎,通過去除材料中的多糖、蛋白質(zhì)、DNA的污染,進一步進行洗滌和沉淀,最終得到純度較高的RNA。有效細胞裂解是提取高質(zhì)量及高產(chǎn)量RNA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8-9],由于發(fā)菜藻體富含膠質(zhì)、色素和多糖等,并且極易大量吸水和細胞壁堅硬的特性造成了RNA提取困難,對發(fā)菜藻體和細胞破碎以及緩沖液的選擇無疑成為提取其RNA的關(guān)鍵步驟。筆者進行了幾種破碎方法的比較,發(fā)現(xiàn)采用反復(fù)多次液氮研磨是破碎發(fā)菜藻體和細胞的理想方法。然而研磨過程中還應(yīng)確保研磨用力恰當、液氮充足,避免材料溶解,而且研磨時間不宜過長(小于8 min)。
根據(jù)不同試驗?zāi)康暮筒牧?,RNA提取可采用不同的方法[10-11]。李亞軍等研究表明,Trizol法能更簡單有效獲得萊茵衣藻中高質(zhì)量的RNA,而最適合提取微芒藻中高質(zhì)量RNA的方法是SDS-LiCl沉淀法[12]。本研究結(jié)果表明,Omega試劑盒法所提取的RNA伴隨雜質(zhì)較多;Trizol法和改良Trizol法均不適用于發(fā)菜藻體RNA的提取,D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm 都與標準數(shù)值相差甚遠;天根試劑盒法是發(fā)菜總RNA提取的理想選擇,所得發(fā)菜RNA基本可以滿足RT-PCR要求,但仍達不到轉(zhuǎn)錄組測序的要求。通常情況下,試劑盒法所提取的RNA質(zhì)量并不高,原因是不同材料組織結(jié)構(gòu)以及其中所含物質(zhì)的種類不同,導(dǎo)致試劑盒在提取過程中并不理想,因此,試劑盒使用應(yīng)根據(jù)試驗?zāi)康募霸囼灢牧系奶匦赃M行適當改進。王友華等用改進的熱酚提取法獲得了高質(zhì)量的棉花根總RNA[13];王春暉等通過對2種試劑盒法和改良的異硫氰酸胍法的比較,得出改良的異硫氰酸胍法所提出的棉花幼根總RNA能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測序要求[14];楊曉燕等針對3種常用RNA提取試劑盒對紅地球葡萄葉樣品RNA的提取效果進行評估和優(yōu)化,結(jié)果顯示最適于提取葡萄葉片總RNA的為RNeasy Plant Mini Kit試劑盒,同樣需要延長提取試劑與樣品的接觸時間從而提高RNA的提取質(zhì)量[8]。筆者對Omega RNA提取試劑盒、Trizol RNA提取法、天根試劑盒等3種方法進行優(yōu)化,結(jié)果表明,天根試劑盒法所提發(fā)菜RNA質(zhì)量最高,達到轉(zhuǎn)錄組測序要求。