利用染色體片段代換系定位水稻HL型育性恢復(fù)基因

張宏根等

摘要：以水稻9311為背景、日本晴為供體構(gòu)建的一套染色體片段代換系為試驗(yàn)材料，利用HL型秈稻不育系粵泰A與代換系測交，根據(jù)測交F1群體的花粉育性和小穗育性，結(jié)合Bin-map，采用多元回歸的方法，對HL型粵泰A的育性恢復(fù)QTL進(jìn)行分析。以花粉育性為指標(biāo)檢測到3個(gè)QTLs，分別位于第2、6和10染色體上，定位區(qū)段大小為 379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性為指標(biāo)檢測到3個(gè)QTLs，分別位于第1、第3和第11染色體上，定位區(qū)段大小為455 070、525 340、247 226 bp。

關(guān)鍵詞：水稻；染色體片段代換系；恢復(fù)基因；基因定位

中圖分類號： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0064-04

收稿日期：2014-09-06

基金項(xiàng)目：國家“973”計(jì)劃（編號：2011CB100101）；國家自然科學(xué)基金（編號：31071384）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：13KJ13210008）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

作者簡介：張宏根（1981—），男，江蘇南通人，博士，講師，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail：zhg@yzu.edu.cn。

通信作者：湯述翥，教授，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail：sztang@yzu.edu.cn?！糉L（2K2]目前，我國主要有9種胞質(zhì)不育系類型用于生產(chǎn)，以野敗（WA）型、紅蓮（HL）型和包臺（BT）型為3種代表類型[1]。WA型不育系敗育徹底、不育性穩(wěn)定，在雜交秈稻生產(chǎn)利用中占據(jù)主導(dǎo)地位。近年來，HL型不育系在雜交秈稻中應(yīng)用越來越廣泛。雜交粳稻以利用BT型不育系為主，推廣面積較小。要發(fā)展三系雜交稻，HL型雜交秈稻在生產(chǎn)上進(jìn)一步的利用是一條重要途徑。HL型不育系的恢復(fù)譜較廣，但強(qiáng)恢復(fù)系很少，恢復(fù)系選育是限制HL型雜交秈稻進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。

質(zhì)核互作雄性不育系的育性恢復(fù)是一復(fù)雜的遺傳性狀，并且環(huán)境對目標(biāo)性狀表型的影響較大。已有的研究表明，HL型不育系花粉表現(xiàn)為圓敗，其育性恢復(fù)由主效基因與微效基因共同控制，且基因間可能存在互作[2-4]。目前，在秈稻核背景下，HL型不育系的主效育性恢復(fù)基因已被定位[5-9]，而微效基因的定位及基因效應(yīng)研究相對較少[10]。因此，有效地開展HL型不育系微效基因的定位是選育HL型強(qiáng)恢復(fù)系的關(guān)鍵。

如何對微效恢復(fù)基因進(jìn)行定位是育性恢復(fù)遺傳研究的難點(diǎn)。染色體片段代換系與受體親本的遺傳背景基本一致，其與受體親本之間以及系與系之間只有單個(gè)或少數(shù)的染色體片段的差異，因此其表現(xiàn)出的任何差異都可以直接與導(dǎo)入的片段或被替換的片段聯(lián)系起來，是進(jìn)行QTL分析及精細(xì)定位目標(biāo)QTL的理想材料。目前，在水稻中已經(jīng)有很多的學(xué)者利用染色體片段代換系來定位重要性狀的QTL[11-16]。為定位HL型秈稻不育系的微效恢復(fù)基因，本試驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上以水稻9311為背景、日本晴為供體構(gòu)建的一套染色體片段代換系為試驗(yàn)材料（利用高通量測序?qū)γ恳粋€(gè)系基因組進(jìn)行了重新測序，每個(gè)系中的代換片段長度及位置均準(zhǔn)確獲知），其中9311為HL型強(qiáng)恢復(fù)系，日本晴為HL型不育系的保持系，利用HL型秈稻不育系粵泰A與代換系測交，根據(jù)測交F1群體的花粉育性和小穗育性，結(jié)合Bin-map，采用多元回歸的方法，對HL型不育系育性恢復(fù)的QTL進(jìn)行分析，相關(guān)研究結(jié)果有助于HL型恢復(fù)系的選育。

1材料與方法

1.1供試材料

以粳稻測序品種日本晴為供體，秈稻測序品種9311為受體構(gòu)建的128個(gè)染色體片段代換系（C1-C128），9311及HL型秈稻不育系粵泰A。

1.2群體配置

2010年正季在揚(yáng)州種植親本9311、HL型粵泰A及128個(gè)CSSLs，并配制F1：HL型粵泰A/128CSSLs。成熟時(shí)實(shí)際收到119個(gè)測交F1組合的種子。

2011年春季在海南種植親本9311、HL型粵泰A、128個(gè)CSSLs以及2010年正季獲得的各F1，并繼續(xù)配制HL型粵泰A/128CSSLs。成熟時(shí)收獲各F1種子。

2011年正季在揚(yáng)州種植各親本以及海南收獲的各測交F1，每份材料各種植10苗。由于2011年海南春季溫度偏低，配制的一些雜交組合未能收到雜交種，以及播種后一些雜交種沒有成苗或后期因病枯死而缺苗，最終在配制測交群體中實(shí)際得到的測交系數(shù)目為116個(gè)。

1.3抽穗期調(diào)查

抽穗后及時(shí)記載抽穗期（50%的稻穗抽穗），并折算成播種至抽穗的天數(shù)表示。

1.4花粉育性鑒定與小穗育性鑒定

每天07：00—09：00，在田間每個(gè)測交系中選取4株單株，從每個(gè)始花植株上選取1個(gè)已抽出約1/3的主穗或較大分蘗穗。鏡檢時(shí)，在每個(gè)穗子的中上部枝梗中，選取3朵當(dāng)天要開放的穎花，用1%I2-KI液染色、壓片，在低倍顯微鏡下觀察花粉育性。根據(jù)花粉粒的形狀和對I2-KI液的染色反應(yīng)，將花粉劃分為典敗、圓敗、染敗和正常4種類型。觀察時(shí)，選擇分布均勻、花粉數(shù)目超過100粒的視野，分別記錄4類花粉的數(shù)目，計(jì)算4類花粉的百分率。

在抽穗期間，每天07：00—09：00，選取尚未開花的小穗套袋，自交袋大小為50 cm×20 cm，每系2個(gè)袋子，每個(gè)袋子2個(gè)小穗。20 d后，剔除折斷或自交袋破損的穗子，調(diào)查群體單株的自交小穗育性。

待種子成熟后，每測交系選取4個(gè)主莖穗考察自然小穗育性。

1.5水稻DNA提取與分子標(biāo)記分析

水稻基因組DNA的提取采用CTAB法[17]。普通PCR采用20 μL的反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，03 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。富含GC含量模板的20 μL反應(yīng)體系包括：DNA，2×GCI緩沖液10 μL，2.5 μmol/L的dNTP 3.2 μL，0.3 μmol/L的引物20 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s（溫度因引物不同而異），72 ℃延伸50 s（不同長度的預(yù)期產(chǎn)物按 1 kb/min 調(diào)整延伸時(shí)間），擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，18 ℃保溫。PCR反應(yīng)產(chǎn)物首先在3%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP Bioimaging Systems凝膠成像儀上成像。