摘要：分析山羊卵泡數(shù)量對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響，根據(jù)卵泡數(shù)量將卵巢分為3組，探討卵泡多少對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響。卵泡數(shù)目大于14個(gè)的設(shè)為Ⅰ組，卵泡數(shù)目介于8～14個(gè)之間的設(shè)為Ⅱ組，卵泡數(shù)目在1～7個(gè)之間的設(shè)為Ⅲ組。3組卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞體外成熟率分別為61.68%、70.26%、63.09%；Ⅱ組的卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于其他2組。3組之間孤雌激活胚、克隆胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率無(wú)顯著差異。來(lái)源于卵泡數(shù)介于8～14個(gè)卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟率最高，卵巢卵泡數(shù)量?jī)H影響卵母細(xì)胞的體外成熟率，對(duì)發(fā)育能力無(wú)影響。

關(guān)鍵詞：山羊；卵巢；卵母細(xì)胞；體外成熟

中圖分類(lèi)號(hào)： S827.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0232-03

卵母細(xì)胞體外成熟是在體外人工設(shè)定的條件下，初級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的生長(zhǎng)發(fā)育最終形成具有受精能力的MⅡ期成熟卵母細(xì)胞的過(guò)程。卵母細(xì)胞體外成熟可充分利用卵巢豐富的卵母細(xì)胞資源用于體外受精、體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究以及發(fā)育生物學(xué)機(jī)理等研究，是現(xiàn)代胚胎生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。通過(guò)超數(shù)排卵等方法獲取成熟卵母細(xì)胞的成本較高，且資源有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足不了當(dāng)前科研、生產(chǎn)的需求。目前主要的解決手段是采集屠宰場(chǎng)卵巢，獲取大量未成熟的卵母細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)成熟，進(jìn)而應(yīng)用于科研、生產(chǎn)。山羊卵母細(xì)胞體外成熟影響因素較多，主要包括運(yùn)輸溫度、卵丘顆粒細(xì)胞、卵泡直徑、激素、小分子化合物、培養(yǎng)時(shí)間等。屈雷等[1]、孫新明等[2]研究認(rèn)為，卵巢運(yùn)輸溫度在25 ℃左右時(shí)，卵母細(xì)胞成熟率顯著高于運(yùn)輸溫度接近37 ℃時(shí)的成熟率。劉海軍等研究表明，卵丘顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟具有顯著影響，卵丘顆粒細(xì)胞層數(shù)在3層以上的卵母細(xì)胞成熟率最好[3]。葉華虎等發(fā)現(xiàn)，直徑小于1.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞僅有個(gè)別能完成成熟和卵裂，大于1.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞具有核成熟能力，直徑大于2.5 mm卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞能較好地支持胚胎繼續(xù)發(fā)育[4]。Kordan等研究表明，促卵泡素和促黃體素聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高山羊卵母細(xì)胞成熟率和受精后胚胎的發(fā)育率[5]。王艾平等研究表明，表皮生長(zhǎng)因子對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用[6]。王超等發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h或26 h的卵母細(xì)胞體外成熟率最好[7]。許杰等研究表明，繁殖季節(jié)卵母細(xì)胞的成熟率明顯高于非繁殖季節(jié)[8]。屠宰場(chǎng)采集的山羊卵巢上卵泡數(shù)量差異較大，這可能與山羊年齡、生理狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)水平等因素有關(guān)。卵泡數(shù)量是否影響卵母細(xì)胞的體外成熟以及后期的胚胎發(fā)育尚不清楚，也未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本試驗(yàn)分析了不同卵泡數(shù)量卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞體外成熟情況、孤雌激活胚發(fā)育能力以及克隆胚發(fā)育能力，探討卵泡數(shù)量對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響，旨在為山羊體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因山羊及其他胚胎工程研究提供參考。

1材料與方法

1.1試劑

本試驗(yàn)所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1卵巢分組自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)采集山羊卵巢，立即放入無(wú)菌的生理鹽水（含青霉素、硫酸鏈霉素各100 IU/mL）中，3 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，卵巢到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)的溫度為23～28 ℃。將卵巢用28 ℃滅菌生理鹽水（含硫酸慶大霉素100 IU/mL）反復(fù)沖洗3次，剪去輸卵管等附屬組織，再用生理鹽水反復(fù)清洗干凈，計(jì)算卵巢表面卵泡數(shù)量，共統(tǒng)計(jì)100個(gè)卵巢，確定卵泡數(shù)量的最大值、最小值，對(duì)最大值與最小值的差值進(jìn)行等分，最終確定卵泡數(shù)量大于14個(gè)的卵巢為Ⅰ組，介于8～14個(gè)之間的為Ⅱ組，介于1～7個(gè)之間的為Ⅲ組。

1.2.2卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)將分組的卵巢置于加有撿卵液的平皿中，用手術(shù)刀片切割2～6 mm卵泡，使得卵母細(xì)胞隨卵泡液進(jìn)入撿卵液，最后在體視顯微鏡下收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocytes complexs，COCs）。撿卵液為T(mén)CM199（GIBCO）培養(yǎng)液。將挑選的COCs用37 ℃預(yù)熱2 h的卵母細(xì)胞體外成熟液洗3次，轉(zhuǎn)移到含2 mL成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，在38.5 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、最大飽和濕度中培養(yǎng)23 h。卵母細(xì)胞體外基礎(chǔ)成熟液：TCM199培養(yǎng)液添加 0.22 mg/L 丙酮酸鈉、10 μg/mL FSH（寧波第二激素廠(chǎng)）、20 μg/mL LH（寧波第二激素廠(chǎng)）、1 μg/mL 17β-E2、20%胎牛血清（GIBCO），同時(shí)添加1%（體積分?jǐn)?shù)）的轉(zhuǎn)鐵蛋白-胰島素-亞硒酸鈉（ITS）、10 ng/mL EGF。

1.2.3卵母細(xì)胞體外成熟率的統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后，將COCs移入3 g/L透明質(zhì)酸酶溶液中，用移液槍反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，去除外周顆粒細(xì)胞，用操作液洗3次，操作液為T(mén)CM199添加20%的胎牛血清，最后于顯微鏡下挑選具有第1極體的卵母細(xì)胞，具有極體的細(xì)胞與培養(yǎng)細(xì)胞的比值即為成熟率。

1.2.4手工克隆胚的構(gòu)建山羊手工克隆胚的構(gòu)建參照于鴻浩等的方法[9-10] 進(jìn)行。利用鏈酶蛋白酶去除卵母細(xì)胞透明帶，將其轉(zhuǎn)入操作液中恢復(fù)15 min以上，然后將其轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞松馳素B的操作液中進(jìn)行手工去核，去核時(shí)利用胚胎切割刀切除靠近極體部位三分之一左右的卵母細(xì)胞胞質(zhì)。收集無(wú)核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)作為受體，40 d P4～P6代陜北白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞為供核細(xì)胞。分別轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞、供體細(xì)胞至植物血凝素溶液中，形成2個(gè)受體細(xì)胞夾雜1個(gè)供體細(xì)胞的復(fù)合體。細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)電融合后形成克隆胚，再用ionomycin、6-DMAP聯(lián)合激活。

1.2.5克隆胚的培養(yǎng)將激活的克隆胚胎移入G1胚胎培養(yǎng)液（上海內(nèi)湖國(guó)際貿(mào)易有限公司）中進(jìn)行體外培養(yǎng)。48 h后檢查卵裂情況，將形態(tài)良好的分裂卵移入G2培養(yǎng)液（上海內(nèi)湖國(guó)際貿(mào)易有限公司）中，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，檢查胚胎發(fā)育情況。克隆胚培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、最大飽和濕度。

1.2.6成熟卵母細(xì)胞孤雌激活將挑選的成熟卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5 μmol/L ionomycin 的TCM199培養(yǎng)液中激活5 min，用操作液洗3次，最后轉(zhuǎn)移到2.5 mmol/L 6-甲基氨基嘌呤培養(yǎng)液中，在38.5 ℃、5%CO2、最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中作用4 h，按照克隆胚培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞體外成熟率

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞體外成熟率分別為6168%、70.26%、63.09%。Ⅱ組卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于Ⅰ組、Ⅲ組。Ⅰ組、Ⅲ組之間成熟率無(wú)顯著差異2.3不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞孤雌激活囊胚率

孤雌激活培養(yǎng)至第6天觀(guān)察囊胚發(fā)育情況。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組孤雌激活囊胚發(fā)育率分別為20.89%、18.19%、21.60%。3組之間差異不顯著（表3）。表3不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞孤雌激活囊胚率

2.4克隆胚卵裂率

不同卵巢來(lái)源的成熟卵母細(xì)胞經(jīng)手工克隆技術(shù)制備成體細(xì)胞克隆胚，克隆胚培養(yǎng)48 h，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組卵裂率分別為73.37%、72.53%、73.56%。3組之間差異不顯著（表4）。表4不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞克隆胚卵裂率

組別 卵裂率 （%）重復(fù)1 重復(fù)2 重復(fù)3 重復(fù)4 重復(fù)5 平均Ⅰ7572.7370.276583.8773.37±6.94aⅡ66.6770.2773.6878.1373.9172.53±4.30aⅢ67.7481.5878.137070.3773.56±5.95a

2.5克隆胚囊胚發(fā)育率

克隆胚培養(yǎng)至第6天觀(guān)察發(fā)育情況，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組克隆胚囊胚發(fā)育率分別為12.82%、12.06%、10.88%，3組之間差異不顯著（表5）。表5不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞克隆胚囊胚發(fā)育率

3結(jié)論與討論

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過(guò)程非常復(fù)雜，主要包括卵母細(xì)胞核成熟、胞質(zhì)成熟。卵母細(xì)胞核成熟過(guò)程主要表現(xiàn)為生發(fā)泡破裂、MⅠ期赤道板的形成、同源染色體分離、MⅡ期紡錘體形成、第一極體排出、受精之后第二極體的排出。卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中，生發(fā)泡破裂代表卵母細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)，第一極體排出標(biāo)志著卵母細(xì)胞體外成熟，可以受精。與核成熟相比，胞質(zhì)成熟更為復(fù)雜，包括卵母細(xì)胞內(nèi)部各細(xì)胞器形態(tài)改變和功能建立以及供減數(shù)分裂與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯與修飾，卵母細(xì)胞只有核與胞質(zhì)都充分成熟時(shí)才能成功受精，支持胚胎發(fā)育[11]。本研究以排出的第一極體為標(biāo)準(zhǔn)判斷卵母細(xì)胞核是否成熟，結(jié)果表明，不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞核體外成熟明顯不同，來(lái)源于Ⅱ組卵巢的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后第一極體排出率顯著高于其他來(lái)源的卵母細(xì)胞；以孤雌激活胚和體細(xì)胞克隆胚的卵裂率、囊胚發(fā)育率判斷不同卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟情況，結(jié)果表明，不同來(lái)源的體外成熟卵母細(xì)胞支持孤雌激活胚、體細(xì)胞克隆胚發(fā)育的能力是相同的?？梢?jiàn)，山羊卵泡數(shù)量?jī)H影響卵母細(xì)胞的核成熟率。卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過(guò)程中，激活細(xì)胞核功能非常重要[12]。從單層扁平顆粒細(xì)胞包圍的卵母細(xì)胞到早期有腔卵泡階段的卵母細(xì)胞，其核仁是由染色質(zhì)絲纏繞而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著rRNA合成的增加，核仁由RNA合成場(chǎng)所轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA貯存場(chǎng)所[13]。此外，核孔越來(lái)越明顯，密度增加，核周隙越來(lái)越難以分辨。電鏡結(jié)果顯示，生發(fā)泡期卵母細(xì)胞的核仁由顆粒性纖維成分、空泡及纖維中心組成，染色質(zhì)高度疏松，有明顯的核膜、核仁，核仁正在致密化或已發(fā)生致密化。只有核仁完全致密化，核仁周?chē)腥旧|(zhì)相伴分布，卵母細(xì)胞才獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力[13-14]。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)開(kāi)始后不久，核膜先是有輕微打折，核膜孔消失；與核膜分解行為同步，染色體擴(kuò)散，顯著凝集在核膜內(nèi)緣；然后發(fā)生核膜破裂，直至完全解散，加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，核內(nèi)物質(zhì)與核質(zhì)混合，此過(guò)程即為生發(fā)泡破裂[15]。卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂，完成第1次減數(shù)分裂后，形成次級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)行至第2次減數(shù)分裂中期（MⅡ期），并排出第一極體。因此深入研究挖掘卵泡數(shù)量對(duì)核成熟的影響機(jī)制應(yīng)以細(xì)胞核形態(tài)、功能變化為切入點(diǎn)。卵巢卵泡數(shù)量差異形成可能與動(dòng)物個(gè)體年齡、生理狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)，但由于屠宰場(chǎng)屠宰的動(dòng)物來(lái)源較多、年齡和生理狀態(tài)等不確定性導(dǎo)致探尋卵巢卵泡數(shù)量差異成因較為困難。本研究結(jié)果表明，山羊卵巢卵泡數(shù)量對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟率具有影響，卵泡數(shù)量為8～14個(gè)時(shí)卵巢來(lái)源卵母細(xì)胞體外成熟率最高。建議山羊體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、體外受精等胚胎工程研究選擇收集此類(lèi)卵巢中的卵母細(xì)胞作為試驗(yàn)材料。

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