新疆天山馬鹿布氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查

武軍元等

摘要：采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)對采自新疆3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場、1個(gè)散養(yǎng)鹿群的410份血清樣本進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測；采用分子生物學(xué)方法，根據(jù)GenBank公布的布氏桿菌外膜蛋白Omp25c的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，對疑似布氏桿菌陽性的10份羊水病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector進(jìn)行測序。結(jié)果表明，血清稀釋比例為1 ∶25時(shí)，平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)的抗體陽性率分別為15.1%、14.6%，4份羊水樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上均觀察到預(yù)期149 bp大小的擴(kuò)增條帶，BLAST比對分析顯示該擴(kuò)增序列與布氏桿菌基因組的核苷酸序列同源性為100%，從而判定新疆集約化養(yǎng)殖的天山馬鹿存在布氏桿菌病的感染。

關(guān)鍵詞：布氏桿菌；天山馬鹿；平板凝集；試管凝集；Omp25c

中圖分類號(hào)：S852.61+2；S858.255.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0235-02

布氏桿菌?。╞rucellosis）又稱馬爾他熱、波狀熱，是由布氏桿菌屬（Brucella）細(xì)菌引起的人畜共患病。布氏桿菌可感染人類、多種家畜和野生動(dòng)物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷。該病最典型的癥狀為懷孕母畜流產(chǎn)、空懷不育、子宮炎、乳房炎，以及公畜睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，中國將其列為二類動(dòng)物疫病。全世界有170多個(gè)國家和地區(qū)存在和流行人畜共患布氏桿菌病，每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失約30億美元[1]。根據(jù)其宿主的嗜好性可將布氏桿菌分為豬、牛、羊、犬、綿羊附睪、沙林鼠種布魯氏菌6個(gè)種及20個(gè)型[2]。我國鹿群中流行的布魯氏菌主要為豬型、牛型、羊型、非典型布魯氏菌[3-4]。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國家二類保護(hù)動(dòng)物。目前，關(guān)于新疆天山馬鹿感染布氏桿菌的情況尚未見報(bào)道，更無應(yīng)用分子生物學(xué)手段對天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌流行病學(xué)的檢測及研究。通過對新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖、散養(yǎng)的天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查，以了解當(dāng)?shù)靥焐今R鹿的布氏桿菌感染狀況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1血清及病料來源410份血清樣本分別采自新疆地區(qū)3個(gè)集約化養(yǎng)殖鹿場、1個(gè)散養(yǎng)鹿群；10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料采自新疆地區(qū)集約化養(yǎng)殖鹿場。

1.1.2試驗(yàn)菌株布氏桿菌疫苗株M5購自新疆天康畜牧生物技術(shù)公司。

1.1.3主要試劑及儀器設(shè)備HiPure Gel Pure DNA Kits，購自Magen公司；pGEM-T Easy Vector，購自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；布氏桿菌虎紅平板凝集抗原、布氏桿菌試管凝集抗原、布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布氏桿菌陰性參考血清為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)均為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1虎紅平板凝集試驗(yàn)虎紅平板凝集試驗(yàn)是一種快速、敏感的檢測方法，用于布氏桿菌病的田間篩選，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

1.2.2試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)是一種特異、敏感的布氏桿菌病檢測方法，用于布氏桿菌病的診斷，具體操作及判定方法參照GB/T 18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》。

1.2.3布氏桿菌基因組DNA的制備將疑似布氏桿菌陽性的羊水病料劃線接種于TSA瓊脂平板，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至TSB培養(yǎng)基。取1 mL TSB培養(yǎng)物以12 000 r/min離心5 min，棄上清。

以200 μL TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6）重懸沉淀，于95 ℃煮沸5 min，以12 000 r/min離心 10 min，上清即為細(xì)菌DNA模板。

1.2.4樣品的PCR檢測根據(jù)布氏桿菌特異性基因Omp25c的保守片段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′；Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。

所采用的25 μL反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL、無RNA酶的水17.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆、測序采用HiPure Gel Pure DNA Kits試劑盒，按照說明書對電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化，將純化回收的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy Vector。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α（天根公司產(chǎn)品）并進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選。選擇抗性菌落增菌培養(yǎng)，并采用質(zhì)粒小提試劑盒從擴(kuò)增的細(xì)菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

2結(jié)果與分析

2.1血清學(xué)檢測結(jié)果

用PBS溶液對采集的410份天山馬鹿血清依次進(jìn)行倍比稀釋（1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200），并分別采用平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表1、表2。

2.2PCR檢測結(jié)果

應(yīng)用針對特異性基因Omp25c保守片段設(shè)計(jì)的引物，分別對疑似陽性病料、對照疫苗菌株M5的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，10份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中有4份呈陽性，陽性率為40%，在1.2%瓊脂糖凝膠上觀察到預(yù)期大小為149 bp的擴(kuò)增條帶。采用M13通用引物對PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，并將獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLAST對比，證明所擴(kuò)增及克隆的核酸片段為布氏桿菌Omp25c保守的核苷酸序列。陽性樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，擴(kuò)增子測序序列的BLAST比對分析結(jié)果見圖2。

3結(jié)論與討論

布魯氏菌病是由布氏桿菌引起的一種人獸共患傳染病，布氏桿菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，具有逃避機(jī)體免疫保護(hù)的能力。對于布氏桿菌病的診斷，GB/T18646—2002《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》規(guī)定的虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）一直是我國動(dòng)物布病檢測的經(jīng)典試驗(yàn)方法[5]。然而，對于受到免疫抑制且攜帶病原的宿主動(dòng)物，抗體水平很難達(dá)到有效的檢測滴度，需借助分子生物學(xué)方法來檢測動(dòng)物體內(nèi)的病原體，因此必須篩選布氏桿菌種間高度保守的目的基因，而Omp25c是目前最具代表性的布氏桿菌外膜蛋白之一，具有較強(qiáng)的免疫原性，且在布氏桿菌各種間高度保守[6-7]。以O(shè)mp25c外膜蛋白為研究對象，選取特異性較好的基因片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)布氏桿菌病原菌的檢測。

近年來，新疆地區(qū)多個(gè)畜種均有布氏桿菌病感染的報(bào)道[8-10]，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)厝诵蠼】导靶竽翗I(yè)的安全生產(chǎn)。天山馬鹿是產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)天山山脈的鹿品種，是國家二類保護(hù)動(dòng)物。早期，野生天山馬鹿在新疆較為多見，隨著近年來市場對天山馬鹿所產(chǎn)鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角膠等鹿產(chǎn)品需求的不斷擴(kuò)大，天山馬鹿在新疆呈現(xiàn)集約化養(yǎng)殖的趨勢。有文獻(xiàn)初步報(bào)道，新疆天山馬鹿由野生放養(yǎng)到與其他家畜混養(yǎng)，曾出現(xiàn)過布氏桿菌感染的病例[11-12]，然而上述流行病學(xué)調(diào)查研究均僅限于血清學(xué)水平，不能排除假陽性、假陰性存在的情況。為系統(tǒng)了解新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后，布氏桿菌病在該畜群中的流行狀況，本研究采用血清學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)手段，對當(dāng)?shù)靥焐今R鹿布氏桿菌病的感染情況進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，新疆天山馬鹿集約化養(yǎng)殖后確實(shí)出現(xiàn)了布氏桿菌病感染的病例。對血清樣品進(jìn)行布氏桿菌特異性抗體檢測時(shí)，平行采用虎紅平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)，然而以不同方法對同一批血清測得的陽性率不同，可見僅靠血清學(xué)檢測抗體的方法難以對畜群感染布氏桿菌的程度進(jìn)行定論。以布氏桿菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因?yàn)檠芯繉ο?，?0份疑似布氏桿菌陽性的羊水病料中篩選出4份陽性病例，進(jìn)一步提供了布氏桿菌感染新疆天山馬鹿的證據(jù)。確定感染新疆天山馬鹿的布氏桿菌種型尚需進(jìn)一步研究，從而有針對性地對天山馬鹿進(jìn)行布氏桿菌病的防控。

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