鐘怡平，夏道宗，黃　嵐，王思為，方月娟

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053）

蓮房多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

鐘怡平，夏道宗*，黃嵐，王思為，方月娟

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310053）

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了熱回流提取蓮房多酚的工藝，并通過(guò)測(cè)定其清除ABTS+自由基、DPPH自由基、OH自由基的能力，還原力，亞鐵離子螯合活性及對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，對(duì)蓮房多酚的抗氧化活性進(jìn)行綜合研究。結(jié)果表明，熱回流提取蓮房多酚的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度50%，料液比1∶25，提取溫度80℃，提取時(shí)間為2h，最優(yōu)條件下的得率是5.23%。蓮房多酚的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明蓮房多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基、OH自由基有很強(qiáng)的清除能力，對(duì)亞鐵離子的螯合活性和還原力均較強(qiáng)，并能顯著抑制大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化。本研究表明在該優(yōu)化工藝下提取的蓮房多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

蓮房，多酚，提取，抗氧化

蓮為睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物，是一種常見(jiàn)的藥食兩用經(jīng)濟(jì)作物［1］。蓮類(lèi)藥材（荷葉、蓮房、蓮子、蓮子心、藕節(jié)等）均可作為藥物用來(lái)治療多種疾?。?-3］。我國(guó)蓮資源充足，而作為蓮非可食部分的蓮房卻一直被視為廢棄物丟棄，利用價(jià)值不高。目前關(guān)于蓮房的研究還處于起步階段，開(kāi)發(fā)蓮房不僅具有一定的科學(xué)價(jià)值，還會(huì)帶來(lái)不錯(cuò)的經(jīng)濟(jì)效益。有報(bào)道稱，蓮房中富含多酚，對(duì)蓮房多酚的開(kāi)發(fā)研究空間很大，值得深入考察［4-6］。此外，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在蓮源花青素領(lǐng)域的研究也成果頗豐。植物多酚可以通過(guò)減少自由基的產(chǎn)生而削弱自由基對(duì)機(jī)體的損傷，因此該類(lèi)化合物在醫(yī)藥和保健方面必將有廣泛的應(yīng)用［7-8］。本文采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了熱回流提取蓮房多酚的工藝，并通過(guò)測(cè)定其清除ABTS+自由基、DPPH自由基和OH自由基的能力，結(jié)合亞鐵離子螯合活性和還原力測(cè)定，以及對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響，從化學(xué)、生物學(xué)角度對(duì)蓮房多酚的抗氧化活性進(jìn)行綜合研究，為進(jìn)一步利用和研究蓮房提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蓮房采自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，產(chǎn)地湖南；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、二銨鹽自由基（ABTS）、2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine（TPTZ） 美國(guó)Sigma-A ldrich公司；乙醇、福林酚試劑、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸、抗壞血酸、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、鹽酸、FeCl3、FeSO4、H2O2、KH2PO4、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、Ferrozine、D-脫氧核糖、EDTA-2Na等。

FA2004電子分析天平上海菁海儀器有限公司；R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申勝生物技術(shù)有限公司；低溫冷卻液循環(huán)泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司；GZX-9140 MBE恒溫干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多酚含量的測(cè)定沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取濃度為100μg/m L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8m L于10m L比色管中，加入5m L福林酚試劑、4m L 75g/L的Na2CO3溶液。旋渦混勻15s后，用蒸餾水定容至刻度，40℃放置30m in，顯色。用分光光度計(jì)測(cè)定775nm的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

蓮房多酚含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取已過(guò)20目篩的蓮房粉末2g，加入一定量一定濃度乙醇，于一定溫度下提取，提取一定時(shí)間后進(jìn)行抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸餾水定容至50m L，取1m L定容至100m L，取1m L待測(cè)液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定總酚含量。

蓮房多酚得率（%）=（樣液中多酚含量（mg/L）×樣液體積（L）×稀釋倍數(shù)）÷蓮房質(zhì)量（mg）×100

1.2.2單因素提取實(shí)驗(yàn)為研究乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素對(duì)蓮房多酚得率的影響，分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1乙醇濃度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用0、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%八個(gè)水平，料液比1∶20，在水浴溫度60℃條件下提取1h。

1.2.2.2提取溫度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用40、50、60、70、80、90℃六個(gè)水平。以60%乙醇溶液為溶劑，料液比1∶20提取1h。

1.2.2.3提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用0.5、1、1.5、2、2.5、3h六個(gè)水平，以60%乙醇溶液為溶劑，料液比1∶20，在水浴溫度80℃條件下提取。

1.2.2.4料液比對(duì)蓮房多酚提取效果的影響采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40七個(gè)水平，以60%乙醇溶液為溶劑，在水浴溫度80℃條件下提取1h。

1.2.3正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度作為正交實(shí)驗(yàn)的四個(gè)因素，每個(gè)因素取三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels design of orthogonal experiment

1.2.4體外抗氧化實(shí)驗(yàn)將蓮房多酚配制成八個(gè)濃度500、250、100、50、25、10、5、2.5μg/m L。配制陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸（1mg/m L）：稱取10.0mg抗壞血酸，用蒸餾水定容至10m L。即1000μg/m L，然后稀釋成500、250、 100、50、25、10、5μg/m L系列濃度。

1.2.4.1清除DPPH自由基能力的測(cè)定［9-10］準(zhǔn)確稱取20mg DPPH自由基，用無(wú)水乙醇溶解配制成2× 10-4mol/L的溶液（253.6m L）。取等體積（2m L）待測(cè)液及2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻。室溫下避光放置30m in后用無(wú)水乙醇做參比在517nm下測(cè)定其吸光度Ai，同時(shí)測(cè)定2×10-4mol/L DPPH溶液與等體積無(wú)水乙醇（2m L）混合液的吸光度Ac，以及待測(cè)液（2m L）與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj。根據(jù)式（1）計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，求取試樣清除DPPH自由基的IC50。

DPPH自由基清除率（%）＝［1-（Ai-Aj）］/Ac×100

1.2.4.2清除ABTS+自由基的能力測(cè)定［11］取0.4m L不同濃度的樣品溶液，加入3.6m L 0.0875mmol/L ABTS溶液，漩渦混合后于暗處?kù)o置10m in，測(cè)定734nm的吸光值。對(duì)照管以0.4m L 70%乙醇替代樣品。根據(jù)式（2）計(jì)算清除率，并求取試樣清除ABTS+自由基的IC50。

1.2.4.3還原力的測(cè)定—鐵離子還原法［12］吸取系列濃度FeSO4溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100μL待測(cè)樣品，與3m L FRAP溶液混合，再加300μL體積蒸餾水，在37℃水浴中反應(yīng)4m in，于593nm波長(zhǎng)下讀取吸光值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得待測(cè)樣品相應(yīng)的FeSO4濃度，定義為當(dāng)量濃度（FRAP值）。結(jié)果表示為每mg樣品中相當(dāng)于的FeSO4的量。

1.2.4.4清除OH自由基能力的測(cè)定［13］取0.1m L不同濃度的樣品水溶液，加入0.690m L 20mmol/L pH7.4的KH2PO4-KOH緩沖液（含2.5mmol/L 2-脫氧核糖），然后加入0.1m L預(yù)先混合的1.0mmol/L硫酸亞鐵和1.04mmol/L EDTA（1∶1體積混合）。（反應(yīng)液保持37℃溫浴，常溫放置）加入0.1m L 1.0mmol/L的抗壞血酸和0.01m L 0.1mol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃下溫浴30m in。取出后加入1%硫代巴比妥酸1m L和2.8%三氯乙酸1.0m L，95℃下反應(yīng)15m in以產(chǎn)生顏色。取出立即冷卻，532nm測(cè)吸光值。對(duì)照管以0.1m L蒸餾水代替樣品。

1.2.4.5亞鐵離子螯合活性測(cè)定［12］0.2m L不同濃度的樣品溶液中加入0.2m L 50μmol/L FeSO4和1.4m L 0.15mol/L NaCl溶液，加入0.2m L 300μmol/L菲咯嗪?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，劇烈振搖后（漩渦混合5s），室溫下放置10m in。測(cè)定562nm的吸光值，若吸光值越低，表示對(duì)鐵離子的螯合能力越強(qiáng)?？瞻坠苡?.2m L 0.15mol/LNaCl代替菲咯嗪。

1.2.4.6對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（丙二醛含量及抑制率的測(cè)定）［13］大鼠處死后，在冰臺(tái)上快速取腦，稱重，加10倍量生理鹽水勻漿，制備10%腦勻漿液。取10%新鮮腦勻漿0.6m L，加0.4m L生理鹽水，漩渦混勻，加入0.3m L不同濃度的樣品溶液，加入0.3m L 1mmol/L Fe2SO4，加入0.3m L 10mmol/L H2O2，在37℃下水浴1h后，加入1m L 15%三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)，3000r/m in離心15m in，得上清液，取1.5m L上清液，加入1.0m L 1%的硫代巴比妥酸，100℃反應(yīng)15m in。冷卻（固定冷卻時(shí)間），用分光光度計(jì)測(cè)定532nm的吸光值。對(duì)照管以0.3m L蒸餾水代替樣品。根據(jù)TBA-MDA產(chǎn)物（TBARS）的摩爾消光系數(shù)1.56× 105（mol/L）-1·cm-1計(jì)算MDA的濃度。

1.2.4.7數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均測(cè)定三次，取平均值；采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1回歸方程確立

以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0147X+0.0190（R2=0.9993）

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1乙醇濃度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖1可見(jiàn)，隨著乙醇濃度增大，蓮房多酚得率呈先上升后下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樯彿慷喾咏Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，極性跨度范圍較大，溶劑極性過(guò)大或過(guò)小對(duì)總多酚提取均有一定的影響，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，當(dāng)乙醇濃度為60%左右時(shí)，提取率達(dá)最大值。

圖1　不同乙醇濃度對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield

2.2.2溫度對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖2可見(jiàn)，隨著溫度升高，蓮房多酚得率升高，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，蓮房多酚得率最高，溫度升高加快分子運(yùn)動(dòng)速度，有利于細(xì)胞中多酚物質(zhì)的溶出。但當(dāng)溫度再度升高，得率反而下降，這可能是由于高溫導(dǎo)致了部分蓮房多酚的氧化。

圖2　不同提取溫度對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.2　Effectof extraction temperature on extraction yield

2.2.3提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖3可見(jiàn)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，蓮房多酚提取越充分，效率越高，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致多酚的氧化損耗，最佳提取時(shí)間在1h左右。

圖3　不同提取時(shí)間對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.3　Effectof extraction time on extraction yield

2.2.4料液比對(duì)蓮房多酚提取效果的影響由圖4可見(jiàn)，多酚得率隨著料液比加大而增大，當(dāng)料液比達(dá)1∶25時(shí)，趨勢(shì)不再顯著，趨于穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到1∶25時(shí)，溶劑對(duì)多酚的溶解基本達(dá)到飽和，考慮到成本，可選1∶25為最佳料液比。

圖4　不同料液比對(duì)蓮房多酚得率的影響Fig.4　Effectof solid-liquid ratio on extraction yield

2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素，每個(gè)因素取三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

由表可知，四個(gè)因素對(duì)蓮房多酚物質(zhì)得率的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋緶囟龋玖弦罕龋緯r(shí)間，由于因素B料液比的第2、3個(gè)水平的k值相等，考慮到經(jīng)濟(jì)性，故選擇B2作為其優(yōu)水平。因此，最佳提取工藝為A1B2C3D2，即用50%的乙醇，以1∶25的料液比于80℃提取2h，所得蓮房多酚的得率最高，為5.23%。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of orthogonal experiment

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱取2g蓮房多酚，按最佳工藝A1B2C3D2進(jìn)行提取，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為5.19%、5.21%、5.30%，其平均提取率為5.23%，比正交實(shí)驗(yàn)中含量最高的一組高出0.05%，表明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)選擇出的最佳提取工藝科學(xué)合理，重現(xiàn)性好。

2.5體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.5.1清除DPPH自由基能力如圖5所示，蓮房多酚（TPNU）可以顯著抑制DPPH自由基的產(chǎn)生，且在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系，其IC50=9.03μg/m L，而陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50=12.44μg/m L。TPNU清除DPPH自由基能力略大于VC。鄭麗鋆等［14］研究了蓮房不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用，其中乙醇提取物的IC50值為12.94μg/m L，分析其造成差異的主要原因可能與不同品種和不同產(chǎn)地的蓮房總多酚含量不同有關(guān)。

圖5　蓮房多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5　Capacity of DPPH free radical scavenging by TPNU

2.5.2清除ABTS+自由基的能力如圖6所示，TPNU可有效抑制ABTS+自由基的產(chǎn)生，且在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系，其IC50=26.38μg/m L，而陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50=17.29μg/m L。TPNU清除ABTS+自由基能力比VC略小，但仍有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基的能力。

圖6　蓮房多酚對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6　Capacity of ABTS+free radical scavenging by TPNU

2.5.3還原力由圖7可知，TPNU具有一定的還原力，但比陽(yáng)性對(duì)照VC較小，分別為5.27、9.33μmol/mg。

圖7　蓮房多酚的還原力Fig.7　Reducing power of TPNU

2.5.4清除OH自由基能力OH自由基是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用及造成生物損傷［15-16］。由圖8可知，蓮房多酚濃度為100μg/m L時(shí)，清除率達(dá)到了50%，稍低于VC。

2.5.5亞鐵離子螯合活性鐵被認(rèn)為是脂質(zhì)氧化的重要促進(jìn)劑。對(duì)亞鐵離子的螯合，可以保護(hù)鐵誘導(dǎo)的氧化損傷［17］。由圖9可知，蓮房多酚對(duì)亞鐵離子的螯合小于EDTA，但仍具有較強(qiáng)螯合性，濃度為50mg/L時(shí)，螯合率達(dá)43.2%。

2.5.6對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響由圖10可知，蓮房多酚對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抵抗能力與VC相當(dāng)（最高清除率相等），具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

圖8　蓮房多酚對(duì)OH自由基的清除能力Fig.8　Capacity of hydroxy free radical scavenging by TPNU

圖9　蓮房多酚對(duì)亞鐵離子螯合活性Fig.9　Ferrous ion-chelating capacity by TPNU

圖10　蓮房多酚對(duì)大鼠腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig.10　Influence on lipid peroxidation in rats of TPNU

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮房多酚提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，水浴回流提取蓮房多酚的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度50%，料液比1∶25，提取溫度80℃，提取時(shí)間為2h，得率最高為5.23%。蓮房多酚的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明蓮房多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和OH自由基均具有良好清除作用，清除DPPH自由基能力略大于VC，具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用且具有一定的還原力和亞鐵離子螯合活性。表明蓮房多酚是一種良好的天然抗氧化劑。本研究為工業(yè)化利用豐富的蓮房資源提取蓮房多酚提供了依據(jù)。

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Study on the extraction and antioxidant activity of total phenolic com pounds from the seedpod of Nelumbo Nucifera Gaertn

ZHONG Yi-ping，XIA Dao-zong*，HUANG Lan，WANG Si-wei，F(xiàn)ANG Yue-juan
（College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

The extraction technology of total phenolic com pounds from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn（TPNU）was studied by sing le-fac tor experiments and orthogonal test design.Furthermore，the antioxidant activities of TPNU were evaluated，using various antioxidant assays inc luded the scavenging on DPPH，ABTS+，OH free rad icals，reducing power determ ination，ferrous ion-chelating capacity and influence on lip id peroxidation in rats.The results showed that the op timum extrac tion cond itions were determ ined by orthogonal experiment as follows：ethanol concentration 50%，solid-liquid ratio 1∶25，extraction tem perature 80℃ and extraction time 2h，and the extrac tion yield was 5.23%in these conditions.TPNU had strong scavenging activity on DPPH，ABTS+and OH free rad icals，also had strong reducing power and ferrous ion-chelating capacity.In addition，TPNU could significantly inhibit the b rain lipid peroxidation in rats.These findings showed that TPNU had strong antioxidantactivity under the op timalextraction technology.

seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn；totalphenolic com pounds；extraction；antioxidantactivity

TS201.1

B

1002-0306（2015）06-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.044

2014-07-07

鐘怡平（1992-），女，本科，研究方向：功能性食品。

夏道宗（1978-），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品。

國(guó)家自然科學(xué)基金（81374048，81102861）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目暨浙江省新苗人才計(jì)劃（2013R410018，2014R410003）。