劉楊，包華音，張峰

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院，山東濟南250100）

不同產(chǎn)地及品種金銀花中綠原酸和木犀草苷含量測定

劉楊1，包華音1，張峰2，*

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院，山東濟南250100）

測定不同產(chǎn)地、品種金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量。按照2010年版《中國藥典》金銀花項下規(guī)定的HPLC法分別測定各樣品中綠原酸和木犀草苷的含量。結(jié)果表明13個不同產(chǎn)地來源、品種的金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內(nèi)，均符合藥典標準。山東平邑來源金銀花的綠原酸和木犀草苷含量明顯高于其它產(chǎn)地，其中，以平邑地產(chǎn)金銀花質(zhì)佳。結(jié)論：不同產(chǎn)地來源、品種的金銀花質(zhì)量有一定差異，在引種栽培時應(yīng)選擇優(yōu)良品種。本研究結(jié)果可為金銀花引種栽培和人工培育提供參考依據(jù)。

金銀花；綠原酸；木犀草苷；HPLC；含量測定

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，味甘性寒，具有清熱解毒，疏散風熱的功效，主要用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發(fā)熱等癥的治療［1］。研究表明，有機酸類和黃酮類化合物為金銀花的主要有效成分［2］，具有抗菌、抗病毒、增強免疫、抗腫瘤、解熱抗炎、保肝利膽、抗氧化等多種藥理作用［3-5］。2010版《中國藥典》規(guī)定以綠原酸和木犀草苷作為金銀花的質(zhì)控成分。本研究通過HPLC方法測定不同產(chǎn)地來源、不同品種的金銀花栽培品中綠原酸和木犀草苷的含量，以期篩選出章丘龍山基地生長的優(yōu)質(zhì)金銀花種質(zhì)資源，為金銀花藥材的質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1 儀器

日立L-2000高效液相色譜儀（安捷倫進樣器、L-2400紫外檢測器、D-2000elite色譜工作站）；Sartorius CP225D電子天平（d=0.01mg）；數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；超聲清洗儀：昆山市超聲清洗有限公司；Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；DIKMA苯基硅烷鍵合硅膠柱（Inertsil PH-3，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試劑

甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：T20111220）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純，批號：T20110727）；娃哈哈純凈水；乙腈（國藥集團化學試劑有限公司，色譜純，批號：20120206）；綠原酸（MUST-12031401）；木犀草苷（MUST-12041703）。

1.3 藥材

藥材于2013年5月23日采自山東省濟南市章丘龍山基地，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學生藥系李峰教授鑒定為金銀花。藥材詳細信息見表1。將藥材干燥后粉碎，過四號篩，備用。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

綠原酸色譜條件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；檢測波長為327 nm；流速1 mL/min，柱溫為室溫；進樣量為20 μL，理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。

表1 不同產(chǎn)地及品種的金銀花藥材Table 1Lonicera japonica of different habitats and kinds

木犀草苷色譜條件：苯基柱（InertsilPH-3，250mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈為流動相A，以0.5%冰醋酸溶液為流動相B，按下列條件進行梯度洗脫：0 min～15 min，A（10%～20%），B（90%～80%）；15 min～30 min，A（20%），B（80%）；30 min～40 min，A（20%～30%），B（80%～70%）。檢測波長為350 nm，流速1 mL/min，柱溫為室溫；進樣量為20 μL，理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20 000。

2.2 對照品溶液的制備

分別稱取一定量的綠原酸和木犀草苷對照品置于10 mL棕色容量瓶中，綠原酸對照品加入一定量50%甲醇使溶解，木犀草苷對照品加入70%乙醇使溶解，超聲一段時間，然后再用各自的溶劑補足至刻度，搖勻，最后制成綠原酸40 μg/mL，木犀草苷40 μg/mL作為對照品溶液。

圖1 綠原酸標準品（A）和木犀草苷標準品（B）的HPLC圖譜Fig.1HPLC chromatogram of chlorogenic acid standard（A）and luteoloside standard（B）

2.3 供試品溶液的制備

綠原酸供試品溶液的制備：精密稱定藥材粉末0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，稱重并用50%甲醇補足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

圖2 綠原酸供試品（C）和木犀草苷供試品（D）的HPLC圖譜Fig.2HPLC chromatogram of chlorogenic acid sample（C）and luteoloside sample（D）

木犀草苷供試品溶液的制備：精密稱定藥材粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取1 h，稱重并用70%乙醇補足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 標準曲線的繪制

綠原酸標準曲線繪制：配制濃度分別為10、20、32、40、80、100 μg/mL的綠原酸對照品溶液，按“2.1”色譜條件測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，得回歸方程Y=2 937.4X-147.89（r=0.99 98），綠原酸濃度在10 μg/mL～160 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

木犀草苷標準曲線繪制：配制濃度分別為10、30、40、50、60、80μg/mL的木犀草苷對照品溶液，按“2.1”色譜條件測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，得回歸方程Y=2.8×106X-22 845（r=0.999 7），木犀草苷的濃度在10 μg/mL～80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2”中配制的木犀草苷和綠原酸的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測定峰面積。計算其保留時間的RSD值分別為0.58%和0.71%，峰面積的RSD值分別為1.68%和0.31%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取9號樣品的木犀草苷供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣，每次20 μL，測定峰面積，結(jié)果保留時間和峰面積的RSD值分別為1.26%、1.68%。取10號樣品的綠原酸供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h進樣，每次20 μL，測定峰面積，結(jié)果保留時間和峰面積的RSD值分別為1.29%、1.96%。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取8號樣品的木犀草苷供試品溶液，13號樣品的綠原酸的供試品溶液，分別進樣6次，每次20 μL，測定峰面積，結(jié)果保留時間RSD值分別為1.23%、0.52%，峰面積RSD值分別為1.76%、1.27%。

2.8 加樣回收率試驗

取已測知木犀草苷和綠原酸含量的樣品6份，精密稱定，再準確加入一定量的木犀草苷和綠原酸的對照品，加入相應(yīng)的溶劑，按照“2.3”中的方法提取并測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2和表3。

表2 綠原酸的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 2The recovery test results of chlorogenic acid（n=6）

表3 木犀草苷的加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table 3The recovery test results of luteoloside（n=6）

2.9 綠原酸和木犀草苷的含量測定

對下列13個不同產(chǎn)地和品種的金銀花藥材分別按照“2.3”方法提取綠原酸、木犀草苷供試品溶液，按照“2.1”中的色譜條件，測定樣品中綠原酸和木犀草苷的含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地、品種金銀花栽培品綠原酸、木犀草苷的含量測定Table 4Chlorogenic acid and luteoloside content determination of Lonicera japonica of different habitats and kinds

3討論

2010年版《中國藥典》金銀花項下規(guī)定按干燥品計，含綠原酸不得低于1.5%，含木犀草苷不得低于0.050%。本研究中不同產(chǎn)地來源和品種的金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內(nèi)，均顯著高于藥典標準，均為質(zhì)優(yōu)的藥材。

本研究中，以綠原酸的含量為指標計算，13號平邑金銀花含量最高，其次是平邑地產(chǎn)金銀花（7號）和平邑大毛金銀花（6號）產(chǎn)的金銀花。以木犀草苷含量為指標計算，7號平邑地產(chǎn)金銀花含量最高，其次是平邑樹型金銀花（8號）、平邑雞爪花（10號）、平邑四季金銀花（9號）。山東和河南是金銀花的主產(chǎn)地，通常認為金銀花以山東產(chǎn)量大，而以河南品質(zhì)佳［6］。但從本研究結(jié)果可見，山東平邑來源的金銀花質(zhì)量明顯優(yōu)于其它產(chǎn)地。

金銀花是臨床常用中藥材和藥食同源中藥，有著光明的開發(fā)前景，市場潛力巨大，已由單一藥用向飲料、保健食品、日用化工等領(lǐng)域發(fā)展。金銀花的品質(zhì)受到生長環(huán)境、栽培技術(shù)、采收季節(jié)、加工方法、儲存條件等多種因素的影響［7］。此外，金銀花原植物的種內(nèi)變異很大，在植物形態(tài)、有效成分含量等方面有較明顯的差異［8］。本研究統(tǒng)一選取濟南市章丘龍山基地生長的金銀花，其中，以平邑地產(chǎn)金銀花的綠原酸和木犀草苷含量較高，因此，可初步確定山東平邑地產(chǎn)金銀花質(zhì)佳?？梢?，不同栽培品種的金銀花質(zhì)量有一定差異，所以在引種時應(yīng)考慮優(yōu)良品種。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：205

［2］邢俊波，李會軍，李萍，等.忍冬花蕾化學成分研究［J］.中國新藥雜志，2002，11（11）：856

［3］王力川.金銀花的化學成分及功效研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（5）：2036-2037

［4］夏遠，李弟灶，裴振昭，等.金銀花化學成分的研究進展［J］.中國現(xiàn)代中藥，2012，14（4）：26-32

［5］關(guān)炳峰，譚軍，周志娣.金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（10）：127-129

［6］王天志.金銀花的研究進展［J］.華西藥學雜志，2000，15（4）：292

［7］李紅霞，王雪芹，李振國，等.不同產(chǎn)地金銀花與山銀花主要成分的含量比較［J］.中國藥房，2011，22（31）：2935-2937

［8］宋平順，衛(wèi)玉玲，陶耀武，等.不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的HPLC法測定［J］.甘肅中醫(yī)學院學報，2008，25（5）：31-34

Determination of Chlorogenic Acid and Galuteolin in Lonicera japonica of Different Kinds and Sources by HPLC

LIU Yang1，BAO Hua-yin1，ZHANG feng2，*
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China；2.Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100，Shandong，China）

To determine the content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources.The content of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica were determined by HPLC according to the Chinese pharmacopoeia ordains.The contents of chlorogenic acid and galuteolin in Lonicera japonica of different kinds and sources were 2.23%-3.16%and 0.085%-0.193%respectively，which were allaccordance with pharmacopeia's standard.The quality of Lonicera japonica from Shandong pingyi was obviously superior to other habitats，and that of Pingyi dichan was the best.There was difference in the quality of Lonicera japonica of different kinds and sources.The study provides

for artificial cultivation and quality evaluation of Lonicera japonica.

Lonicera japonica；chlorogenic acid；luteoloside；HPLC；content determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.030

2013-12-23

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（2011LZ01-03）

劉楊（1981—），女（漢），本科，研究方向：中藥資源與質(zhì)量控制。

*通信作者：張鋒（1979—），女，副研究員，博士，從事藥用植物育種與栽培研究。