黃漢光 湯綺明 蘇瑛 許沖 崔紅艷 常羽 黃駿騰

摘要 [目的]了解雷州黑鴨磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1（phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID 1）基因的序列結(jié)構(gòu)特征及其蛋白的功能，為利用其改善雷州黑鴨肉品質(zhì)與提高肉風(fēng)味提供分子理論依據(jù)。[方法]采用RTPCR方法克隆雷州黑鴨PID1基因部分序列，測序后比對(duì)其同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)與功能。[結(jié)果]該核苷酸序列長度為369 bp，編碼80個(gè)氨基酸，且大多為疏水性氨基酸。與人、牛、雞等物種進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨PID1基因序列與雞具有高度同源性，同源性高達(dá)94%，且雷州黑鴨與雞聚于同一系統(tǒng)發(fā)育支。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽，氨基酸序列呈疏水性，位于細(xì)胞質(zhì)中。[結(jié)論]雷州黑鴨的PID1基因與雞的親緣關(guān)系最近，其蛋白主要功能是在細(xì)胞質(zhì)中參與肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 雷州黑鴨；PID1；克隆；蛋白功能分析

中圖分類號(hào) S834+.89 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）34-207-04

肌內(nèi)脂肪（IMF）是衡量鴨肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，與肉的口感嫩度、咀嚼性能及多汁性等密切相關(guān)[1]，適量的肌內(nèi)脂肪不僅改善肉的風(fēng)味，也提高了消費(fèi)者的感官滿意度。肌外膜、肌內(nèi)膜及肌束膜是肌內(nèi)脂肪的主要儲(chǔ)存場所。研究表明，一方面，肌內(nèi)脂肪主要通過溶解肌纖維束的作用來提高肉品質(zhì)的多汁性與口感嫩度，另一方面，磷脂是肌內(nèi)脂肪的主要組成成分，占20%～50%，磷脂通過增加脂肪酸的降解產(chǎn)物，進(jìn)而提高肉香味相關(guān)化合物的含量，從而改善肉的香味[1-2]。磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域 1（Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1）是利用抑制性消減雜交技術(shù)從正常人群與肥胖人群腹部脂肪組織中檢測到的差異性表達(dá)基因，提交 NCBI 后，根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)特征被國際統(tǒng)一命名為PID1基因[1，3]。脂肪沉積能力是衡量動(dòng)物經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要參數(shù)之一，對(duì)脂肪沉積相關(guān)候選基因進(jìn)行研究，可為畜禽品種選育提供參考依據(jù)，進(jìn)而加速育種進(jìn)程。研究表明，PID1基因通過促進(jìn)更多的3T3L1脂肪前體細(xì)胞進(jìn)入染色質(zhì)合成期，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖的作用[3-4]。此外，PID1基因的過表達(dá)對(duì)胰島素受體底物1（insulin receptor sustrate family 1，IRS1）的酪氨酸磷酸化進(jìn)程具有抑制作用，降低機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，進(jìn)而影響脂肪代謝[5]。錢源等[6]對(duì)萊蕪豬PID1基因CDS區(qū)進(jìn)行克隆、表達(dá)，并對(duì)該基因進(jìn)行功能性分析，結(jié)果表明，PID1基因與萊蕪豬的肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)。殷捷等[7]采用RTPCR方法測定了PID1基因在安徽白山羊不同組織的表達(dá)情況，并分析PID1基因與白山羊肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性，結(jié)果表明PID1基因與安徽白山羊的肌內(nèi)脂肪沉積量顯著相關(guān)。目前人類、大鼠、牛、豬、雞的PID1基因的CDS 序列已經(jīng)被克隆，但鴨PID1基因序列的克隆與蛋白功能分析未見報(bào)道，此外，鴨肌內(nèi)脂肪沉積的主效基因尚未確定[8]。筆者根據(jù) GenBank登錄的雞PID1基因序列并參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出長度為 369bp雷州黑鴨的PID1基因CDS序列，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能性分析，為研究雷州黑鴨肌內(nèi)脂肪代謝調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

300 d雷州黑鴨種公鴨1只，頸靜脈放血，取胸肌，置于液氮中進(jìn)行速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與設(shè)備

DEPC、RNAiso Regent、Master Mix（2x）、Gel Extraction Kit、pUCT simple vector、OneLysePlasmid Mini Kit均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit購自寶生物工程（大連）有限公司；LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、緩沖液1×TSS、50 μg/ml Amp/LB固體培養(yǎng)基、50 μg/ml Amp/LB液體培養(yǎng)基均按照要求配制。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成。

根據(jù)GenBank登錄的雞PID1基因序列（登錄號(hào)為NM_001178144.1）分別設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物并標(biāo)記為P1、P2（表1），引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物序列

引物上游（5′3′）下游（5′3′）

P1GCAGCACTTTCAGACCATATTTCCAGAAGAGCATTAGC

P2ACGCTTGCCAGGGAGGATATGTGGTCAGCAGTGCAGTAGG

1.3.2 cDNA片段的制備。

取胸肌50 mg，添加液氮進(jìn)行研磨后，用Trizol提取總RNA。用Eppendorf BioPhotometer plus檢測其濃度和純度。然后使用PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒，參見試劑盒說明書合成cDNA。

1.3.3 目的片斷的擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系（50 μl）：cDNA溶液2.0 μl，上游引物（10 μmol/L）2.0 μl，下游引物（10 μmol/L）2.0 μl，Master Mix（2x）25 μl，dH2O 19 μl。擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10 s（30個(gè)循環(huán)）；延伸72 ℃ 2 min；25 ℃保存產(chǎn)物。

1.3.4

產(chǎn)物回收與測序。采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，后用Gel Extraction Kit試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用pUCT simple與回收的目的片段連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組子，搖菌，用OneLysePlasmid Mimi Kit試劑盒抽取質(zhì)粒，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3.5 序列分析與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測。

所得序列經(jīng)測序后用NCBI進(jìn)行比對(duì)，證明所得序列為雷州黑鴨PID1基因CDS區(qū)，后將該序列翻譯成蛋白質(zhì)，利用NCBI和DNAMAN的BLAST分析軟件分析所獲得的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用ExPASy服務(wù)的各種在線軟件對(duì)該蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷州黑鴨PID1基因的序列分析

測序結(jié)果顯示，所得雷州黑鴨PID1基因核苷酸序列長度為367 bp，與預(yù)期相同。該核苷酸序列與雞PID1基因（NM_001178144.1）54～422 bp區(qū)段具有較高相似度，于574～953 bp處有一個(gè)完整的開放閱讀框，具有分析意義。該片段堿基G、C、A、T分別占23.4%、26.4%、26.4%、23.7%，四者所占比例相近，A+T的含量（50.1%）略高于C+G的含量（49.8%）。該序列共編碼80個(gè)氨基酸。

2.2 雷州黑鴨PID1基因的序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

用BLAST在線軟件對(duì)雷州黑鴨與其余物種的PID1基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示同類型物種具有較高同源性，雷州黑鴨與雞的PID1基因同源性高達(dá)94%。基于Kimura雙參數(shù)遺傳模型，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建PID1基因系統(tǒng)發(fā)育樹。人、大猩猩、綿羊、牦牛、牛、豬、鼠、褐家鼠聚在一支，雷州黑鴨與雞聚于同一支，而斑馬魚則單獨(dú)成一支（圖1）。

2.3 雷州黑鴨PID1基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

2.3.1 疏水性分析。

使用ExPASy的ProtScale程序Kyte[9]和Doolittle構(gòu)建疏水性圖譜并計(jì)算蛋白質(zhì)疏水性GRAVY值。結(jié)果顯示，氨基酸序列的兩端呈親水性，疏水氨基酸比例較高，且親水性氨基酸與疏水性氨基酸交替出現(xiàn)（圖2）。

2.3.2 跨膜結(jié)構(gòu)分析。用TMPRED軟件預(yù)測分析雷州黑鴨PID1蛋白分子的跨膜結(jié)構(gòu)。TMPRED分析結(jié)果顯示PID1不存在跨膜蛋白結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.3.3 信號(hào)肽的預(yù)測。

采用ExPASy Proteomics Server中的SignalP 4.0 Serverprediction軟件分析表明，PID1蛋白序列不存在蛋白質(zhì)信號(hào)肽（圖4）。

2.3.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。用HNN軟件預(yù)測雷州黑鴨PID1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示存在隨機(jī)卷曲、延伸結(jié)構(gòu)和alpha螺旋3種二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），延伸結(jié)構(gòu)、alpha螺旋及隨機(jī)卷曲分別占30.0%、11.25%及58.75%。

3 討論

3.1 雷州黑鴨PID1部分堿基序列分析

研究結(jié)果顯示，PID1基因核苷酸序列因物種不同而存在差異性，親緣度高的物種，核苷酸序列相似度越高。BLAST對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，人、大猩猩、綿羊、牦牛、牛、豬、鼠、褐家鼠聚在一支；雷州黑鴨與雞聚于同一支，且同源性高達(dá)94%[9-10]；而斑馬魚則單獨(dú)成一支。這表明，PID1基因在同物種間具有種屬相似性和生物多樣性，同時(shí)不同物種間具有差異性。相近的序列與蛋白結(jié)構(gòu)，其發(fā)揮的功能往往相類似[11]。骨骼肌特異性鈣蛋白酶（Muscle specific calpain，p94）被廣泛應(yīng)用于研究肉的嫩度[12-13]。雷州黑鴨與雞p94基因同源性達(dá)90%以

上，且兩者所表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相近，推測雷州黑鴨p94蛋白同樣參與肌肉嫩度的調(diào)節(jié)功能[11]。研究表明，PID1與動(dòng)物肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)[7，14]。推測由于雷州黑鴨與雞PID1基因同源性高，且雷州黑鴨PID1基因存在一定的自身特異性，是導(dǎo)致雷州黑鴨肉質(zhì)鮮香，肌肉嫩，良好風(fēng)味，成為廣受歡迎的肉產(chǎn)品[15-16]的根本原因。

3.2 雷州黑鴨PID1氨基酸序列疏水性分析

利用雷州黑鴨PID1基因氨基酸序列構(gòu)建的疏水性圖譜，可以看出雷州黑鴨PID1基因氨基酸序列中疏水性氨基酸比例較高，且均勻分布于整個(gè)肽鏈中。錢源等[2，6]對(duì)萊蕪豬PID1基因進(jìn)行克隆、表達(dá)并研究其與肌肉內(nèi)脂肪沉積關(guān)系，結(jié)果顯示豬PID1氨基酸序列整體表現(xiàn)為親水性。疏水性氨基酸可穩(wěn)定蛋白質(zhì)的內(nèi)部構(gòu)象，而親水性則增加了蛋白質(zhì)的溶解性。因此，雷州黑鴨PID1基因編碼的疏水性蛋白質(zhì)比豬的PID1蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

43卷34期 黃漢光等 雷州黑鴨PID1基因部分序列的克隆與蛋白功能分析

3.3 雷州黑鴨PID1蛋白的結(jié)構(gòu)比較與功能分析

SignalP 4.0 Server-prediction軟件分析表明，雷州黑鴨PID1蛋白序列不存在蛋白質(zhì)信號(hào)肽。TMPRED軟件預(yù)測分析雷州黑鴨PID1蛋白分子的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，PID1不存在跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。推測雷州黑鴨PID1前體蛋白于胞質(zhì)合成后，前體蛋白直接在胞質(zhì)內(nèi)加工成成熟蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。這和錢源等[6]在豬PID1基因CDS區(qū)的克隆、表達(dá)及其mRNA表達(dá)與肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)系的研究中的研究結(jié)果豬的PID1蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白是一致的。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，隨機(jī)卷曲占雷州黑鴨PID1蛋白結(jié)構(gòu)的58.75%。而錢源等[2，6]研究結(jié)果表明，豬PID1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以alpha螺旋為主。這可能與動(dòng)物進(jìn)化過程中對(duì)生存環(huán)境及養(yǎng)殖模式的適應(yīng)性演變有關(guān)。

雷州黑鴨的PID1基因與雞的親緣關(guān)系最近，其蛋白主要功能是在細(xì)胞質(zhì)中參與肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控。

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