朱曉南

摘要[目的]尋找水稻LRR型蛋白受體激酶（Leucine rich repeat receptor protein kinase）OsRPK1胞外結(jié)構(gòu)域的互作蛋白。 [方法]以日本晴水稻為研究材料，以水稻根部cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增方法得到OsRPK1胞外結(jié)構(gòu)域基因編碼片段OsRPK1-OD（969 bp）。將該片段插入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7，構(gòu)建重組誘餌載體pGBKT7OsRPK1OD。[結(jié)果]對pGBKT7-OsRPK1OD進(jìn)行毒性檢測和轉(zhuǎn)錄自激活鑒定，酵母生長結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有pGBKT7OsRPK1OD載體的 Y2H Gold細(xì)胞，在SD/Trp、SD/Trp/Xαgal營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上生長出白色菌落，在SD/Trp/Xαgal/AbA固體培養(yǎng)基上生長受到抑制；在SD/Trp生長出含有pGBKT7OsRPK1OD載體的 Y2H Gold酵母菌落大小與轉(zhuǎn)化了空載的酵母菌落大小一致，顯示插入的OsRPK1OD對酵母生長無毒性作用。[結(jié)論]OsRPK1OD無法參與激活轉(zhuǎn)錄酵母中報告基因HIS3，ADE2，MEL1和AUR1C，該片段可以作為誘餌基因篩查水稻cDNA文庫，尋找與之相互作用的蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞水稻受體激酶；OsRPK；酵母雙雜交；誘餌載體

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2015）31-045-02

Construction on Leucine Rich Repeat Receptor Protein Kinase OsRPK1 Extracelluar Domainss Coding Gene as Yeast Two Hybrid Bait Vector of Oryza sativa L.

ZHU Xiaonan

（Jiangnan University Bioengineering academy，Wuxi， Jiangsu 214122）

Abstract[Objective] The aim was to construct leucine rich repeat receptor protein kinase OsRPK1 extracelluar domainss coding gene as yeast two hybrid bait vector of Oryza sativa L.[Method] Using Oryza sativa L. as research material， OsRPK1OD， extracelluar domainss coding gene of a leucine rich repeat receptor protein kinase OsRPK1 was amplified by PCR with rice roots cDNA as template （969 bp）.The fragment was inserted into bait vector pGBKT7 which was used for yeast two hybrid to construct recombinant bait vector pGBKT7OsRPK1OD sucessfully. pGBKT7OsRPK1OD was transformed into Y2H Gold competence cells to do toxic test and autoactivition identification. [Result]The results of strain Y2H Gold showed Y2H Gold cells containing pGBKT7OsRPK1OD could grow up to the white colonies on SD/Trp， SD/Trp/Xαgal plates， and grown inhibited on SD/Trp/Xαgal/AbA plates. The colonies of Y2H Gold containing pGBKT7OsRPK1OD showed the same size with the colonies of Y2H Gold containing pGBKT7， which meant the inserted OsRPK1OD had no toxic effect on yeast growing. [Conclusion] OsRPK1OD couldnt activate the transcription of report genes HIS3，ADE2，MEL1 and AUR1C in yeast two hybrid system. It would make the OsRPK1OD become the bait gene to screen the rice cDNA library and find the interaction protein.

Key words Rice receptor protein kinase； OsRPK；Yeast two hybrid； Bait vector

植物L(fēng)RR型受體蛋白激酶是數(shù)目最龐大的激酶家族之一[1]，廣泛參與植物生長發(fā)育、響應(yīng)外界環(huán)境變化等途徑。植物中對擬南芥油菜素甾醇類（brassinosteroid，BR）信號通路研究較為全面。BR是擬南芥產(chǎn)生的一類特殊活性成分[2]，對植物的多種生理功能產(chǎn)生作用，主要影響莖的伸長、花粉管生長、木質(zhì)部分化和葉片卷曲等，且在多種植物中對其功能進(jìn)行了驗證[3]。擬南芥BRI1是第一個分離出的BR受體[4]，其含有25個LRR結(jié)構(gòu)域；BR另一受體BAK1[5]僅含有5個LRR結(jié)構(gòu)域，同屬于LRRRLK家族[6]；此外，植物BIN2蛋白表達(dá)量在BR存在時表現(xiàn)降低。當(dāng)植物受到BR誘導(dǎo)刺激時， BRI1與BAK1在細(xì)胞膜上形成BRI1BAK1異源二聚體[7-9]，抑制BIN2表達(dá)，核內(nèi)相關(guān)酶類去磷酸化并大量積累從而調(diào)控BR相關(guān)基因的表達(dá)[10]。

OsRPK1基因在植物水稻組織中特異性表達(dá)，且表達(dá)量受生長素、NaCl、干旱等條件因素的誘導(dǎo)影響[3]。SMART在線預(yù)測OsRPK1蛋白含有4個結(jié)構(gòu)域：信號肽區(qū)、4個連續(xù)的串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、S_TKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，即典型的LRR型受體蛋白激酶家族蛋白結(jié)構(gòu)，LRR型胞外受體結(jié)構(gòu)域一般被認(rèn)為是信號結(jié)合中心，開啟信號傳遞和級聯(lián)放大[3]。OsRPK1的CDS全長2 910 bp，編碼LRR區(qū)域的核苷酸為1 605 bp。目前研究表明，OsRPK1基因可能與生長素和高鹽脅迫調(diào)控通路有關(guān)[11]。為尋找水稻LRR型蛋白受體激酶OsRPK1胞外結(jié)構(gòu)域的互作蛋白，筆者以日本晴水稻為材料，構(gòu)建水稻LRR型受體蛋白激酶OsRPK1胞外區(qū)酵母雙雜交誘餌載體。

1材料與方法

1.1材料酵母Y2H Gold菌株、pBGKT7質(zhì)粒（購自美國Clontech公司），野生型日本晴水稻由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存；SD/Trp、Xαgal、Aureobasidin A （AbA）購自美國Clontech公司；DNA限制性內(nèi)切酶Sma I、Bam H I購自寶生物工程（大連）公司；T4連接酶購自寶生物工程（大連）公司；PrimerStar聚合酶購自寶生物工程（大連）公司。

1.2方法

1.2.1OsRPK1OD的PCR擴(kuò)增和誘餌載體構(gòu)建。

根據(jù)OsRPK1OD的基因序列信息，設(shè)計上游引物S1：5′TCCCCCCGGGGACGCTGCGGCGCTCG3′和下游引物S2：5′CGGGGATCCTCCAGCTATGGCACCTGTGCTCATC3′，以野生型日本晴水稻根部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用DNA限制性內(nèi)切酶Sma I、BamH I分別雙酶切OsRPK1OD擴(kuò)增產(chǎn)物和pGBKT7載體，將OsRPK1OD片段和pGBKT7載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，最終雙酶切、測序驗證成功構(gòu)建重組誘餌載體pGBKT7OsRPK1OD。

1.2.2酵母Y2H Gold菌株感受態(tài)制備和重組誘餌載體的轉(zhuǎn)化[12]。酵母Y2H Gold菌株感受態(tài)制備方法、載體轉(zhuǎn)化酵母方法均參照Clontech公司手冊《Yeast Protocols Handbooks》。

1.2.3pGBKT7OsRPK1OD自激活活性檢測[12]。

轉(zhuǎn)化10 ng誘餌載體至Y2H Gold。轉(zhuǎn)化的Y2H Gold細(xì)胞懸浮液分別按1/10、1/100 比例稀釋，取100 μl稀釋液涂布于SD/Trp、SD/Trp/XαGal瓊脂平板（100 mm）上，30 ℃培養(yǎng)4 d至菌落出現(xiàn)為止。

1.2.4pGBKT7OsRPK1OD毒性檢測[12]。

分別轉(zhuǎn)化10 ng誘餌載體、pGBKT7至Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的Y2H Gold細(xì)胞懸浮液分別按1/10、1/100 比例稀釋，取100 μl稀釋液涂布于SD/Trp平板（100 mm）上，30 ℃培養(yǎng)4 d至菌落出現(xiàn)為止。比較轉(zhuǎn)化重組誘餌載體和空載的酵母菌落大小。若該誘餌載體含有毒性，則在相同生長時間內(nèi)，菌落與同期轉(zhuǎn)化了pGKBT7的菌落比較明顯較小。

2結(jié)果與分析

2.1pGBKT7OsRPK1OD載體構(gòu)建

根據(jù)OsRPK1基因序列信息設(shè)計S1、S2引物擴(kuò)增OsRPK1OD片段。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。由圖1A可知，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物條帶大小為1 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。將該PCR產(chǎn)物回收用限制性內(nèi)切酶Sma I、BamH I雙酶切，與已雙酶切的pGBKT7過夜連接，最終獲得重組誘餌載體pGBKT7OsRPK1OD，并進(jìn)行了雙酶切驗證（圖1B）。

2.2pGBKT7OsRPK1OD自激活活性檢測

由于載體pGBKT7自身帶有GAL4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中合成DNAbinding結(jié)構(gòu)域的編碼基因，因此，需要檢測插入了外源基因的重組誘餌載體表達(dá)出的融合蛋白產(chǎn)物對酵母雙雜交系統(tǒng)的報告基因是否具有自激活作用，為后續(xù)篩庫試驗排除自激活產(chǎn)生假陽性的可能。pGBKT7載體上還攜帶Trp的營養(yǎng)合成基因，因而轉(zhuǎn)化了重組誘餌載體pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold菌株可以在SD/Trp培養(yǎng)基上生長。若重組誘餌載體表現(xiàn)出報告基因MEL1、AUR1C的自激活活性，即酵母生產(chǎn)過程中可分解底物XαGal，菌落呈現(xiàn)青藍(lán)色，則該基因不能夠用酵母雙雜系統(tǒng)研究其蛋白之間的相互作用。

從圖2可以看出，轉(zhuǎn)化了pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold在SD/Trp/XαGal培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為白色菌落（圖2B）。說明OsRPK1OD對報告基因MEL1、AUR1C沒有激活作用。

2.3pGBKT7OsRPK1OD毒性檢測

在進(jìn)行篩庫試驗之前需要對重組誘餌載體進(jìn)行毒性檢測，防止誘餌載體的表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白BDOsRPK1OD對酵母Y2H Gold存在毒性作用，若是融合蛋白對酵母生長表現(xiàn)出毒性作用，則會導(dǎo)致后期篩庫過程中，酵母生長狀態(tài)較差，菌體濃度和酵母合子均無法達(dá)到篩庫最低標(biāo)準(zhǔn)，此時需要考慮更換誘餌載體。

將載體pGBKT7OsRPK1OD和pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold，以1/10比例稀釋后涂布SD/Trp瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d出現(xiàn)單菌落。毒性檢測結(jié)果見圖3，與轉(zhuǎn)化空載的酵母（左側(cè)）相比，轉(zhuǎn)化pGBKT7OsRPK1OD的酵母生長狀態(tài)良好（右側(cè)），未表現(xiàn)出菌落直徑過小或者轉(zhuǎn)化效率較低。表明融合蛋白DNA BDOsRPK1OD對酵母Y2H Gold生長無毒性作用。

注：左側(cè).轉(zhuǎn)化pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold菌株在SD/Trp平板上的生長情況；右側(cè).轉(zhuǎn)化pGBKT7的Y2H Gold菌株在SD/Trp平板上的生長情況。

圖3pGBKT7OsRPK1OD對Y2H Gold菌株生長毒性檢測

3結(jié)論

酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母表達(dá)系統(tǒng)和GAL4基因轉(zhuǎn)錄啟動系統(tǒng)，解決了基因表達(dá)量過低而無法檢測出較弱蛋白相互作用。因此，酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)組學(xué)一個方便、快捷而有效的試驗技術(shù)手段[12]。OsRPK1是水稻中新發(fā)現(xiàn)的LRR型受體激酶，且該蛋白表達(dá)受到鹽環(huán)境、植物激素等因素影響。OsRPK1在水稻根部特異表達(dá)，影響水稻生長過程中營養(yǎng)物質(zhì)吸收和根系組織發(fā)育；尋找OsRPK1的胞外配體，發(fā)現(xiàn)OsRPK1上游事件有助于闡明該信號通路機(jī)制。

由于SMART在線預(yù)測OsRPK1蛋白含有4個結(jié)構(gòu)域：信號肽區(qū)、4個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、S_TKc蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，OsRPK1蛋白通過跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍族^定于細(xì)胞膜上，為了尋找與OsRPK1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域相作用的配體，該研究構(gòu)建了pGBKT7OsRPK1OD誘餌載體，轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold菌株后，經(jīng)自激活檢測和毒性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA BDOsRPK1OD融合蛋白無法激活HIS3、ADE2、MEL1、AUR1C等報告基因；同時，GAL4 BDOsRPK1OD融合蛋白對酵母Y2H Gold生長無毒性作用，生長狀態(tài)良好。綜上可知，pGBKT7OsRPK1OD誘餌載體構(gòu)建成功，且轉(zhuǎn)化pGBKT7OsRPK1OD誘餌載體的酵母生長狀態(tài)良好，該載體對酵母雙雜交系統(tǒng)報告基因無激活作用，可以用于水稻cDNA文庫的篩選以尋找OsRPK1OD的互作蛋白。

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