李 亞，趙四方，韓萍芳

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800;2.南通科技職業(yè)學(xué)院 環(huán)境與資源系，江蘇 南通 226007)

丙二酸單對硝基芐酯是一種重要的生物醫(yī)藥中間體，目前該物質(zhì)主要采用化學(xué)方法合成，如由丙二酸和對硝基芐醇經(jīng)過酯化、堿酸調(diào)和及精制等步驟制得［1－2］;或在丙二酸存在條件下，催化丙二酸雙酯水解得到［3］。這些反應(yīng)過程具有原料成本高，反應(yīng)能耗大，后處理程序復(fù)雜，產(chǎn)品純度較低等缺點，且易造成環(huán)境污染。酶催化技術(shù)，尤其是以固定化脂肪酶為催化劑直接催化酯化反應(yīng)可以有效解決這些問題。固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性高、易與底物及產(chǎn)物分離、可重復(fù)利用、提高脂肪酶的利用效率、降低反應(yīng)成本等眾多優(yōu)點，在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、化學(xué)化工及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［4-8］。然而，固定化脂肪酶催化酯化反應(yīng)為非均相反應(yīng)，液態(tài)底物容易在固定化脂肪酶顆粒表面形成邊界層，液相主體中的反應(yīng)底物必須穿過邊界層才能到達固定化脂肪酶分子表面，因而強化底物與固定化脂肪酶、底物與底物之間的傳質(zhì)是提升反應(yīng)速率的關(guān)鍵。

朱凱等［9］和 Liu等［10］研究發(fā)現(xiàn)超聲是一種增強傳質(zhì)作用的有效手段，有助于提升酶促反應(yīng)速率。在固定化脂肪酶催化酯化反應(yīng)中引入超聲，一方面有利于底物由液相主體傳遞到酶分子活性中心及產(chǎn)物的脫離，另一方面可以加速底物的溶解［11］。彭楊等［12］研究發(fā)現(xiàn)超聲會影響脂肪酶的穩(wěn)定性。

筆者將超聲應(yīng)用于固定化脂肪酶Novozym 435催化合成丙二酸單對硝基芐酯反應(yīng)，考察超聲固定化脂肪酶協(xié)同作用對酯化反應(yīng)的影響，對超聲輔助Novozym 435催化合成丙二酸單對硝基芐酯反應(yīng)條件進行優(yōu)化，并與常規(guī)恒溫振蕩水浴方式下的實驗結(jié)果進行對比，以期為合成丙二酸單對硝基芐酯提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

Novozym 435固定化脂肪酶(BR)，南京奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司;丙二酸(AR)、對硝基芐醇(AR)、甲苯(AR)、甲醇(色譜純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;實驗用水為自制去離子水。

1.1.2 實驗儀器

CS-3型水聽器，中科院聲學(xué)研究所;DGCI-1200型超聲處理器(含換能器)，無錫德嘉電子有限公司;HN型超聲波發(fā)生器，無錫市華能超聲電子有限公司;SR8型示波器，江蘇揚中電子儀器廠;DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉實驗設(shè)備有限公司;Summit高效液相色譜儀，美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丙二酸單對硝基芐酯含量測定

采用高效液相色譜法測定丙二酸單對硝基芐酯含量，具體分析條件為采用Alltech-C18色譜柱，柱溫為40℃，紫外檢測器波長254 nm，以0.02 mol/L甲醇-磷酸緩沖溶液(體積比7∶3)為流動相，流速為 0.6 mL/min，取樣量為 20 μL［13］。

1.2.2 丙二酸單對硝基芐酯收率計算

丙二酸單對硝基芐酯的收率計算見式(1)。

式中:n為實際得到丙二酸單對硝基芐酯的物質(zhì)的量，mmol;N為理論丙二酸單對硝基芐酯的物質(zhì)的量(以對硝基芐醇加入量計)，mmol。

1.2.3 反應(yīng)時間和溫度對酶促合成丙二酸單對硝基芐酯的影響

在100 mL三角瓶中加入0.4 g Novozym 435，振蕩使酶分散均勻?？焖偌尤?.5 g對硝基芐醇和0.34 g丙二酸及一定體積甲苯溶劑，分別置于振蕩水浴(180 r/min)或連續(xù)作用的超聲反應(yīng)器(聲強為0.5 W/cm2)中反應(yīng)，考察反應(yīng)時間和溫度對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響。

1.2.4 底物濃度和Novozym 435濃度對酶促合成丙二酸單對硝基芐酯的影響

分別在超聲聲強0.5 W/cm2、頻率20 kHz、溫度30℃、反應(yīng)時間5 h作用下和溫度45℃、反應(yīng)時間8 h的振蕩水浴中考察對硝基芐醇濃度和Novozym 435濃度對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響。

1.2.5 超聲對酶促合成丙二酸單對硝基芐酯的影響

在3.0 g/L Novozym 435、4.0 g/L對硝基芐醇、反應(yīng)時間為5 h、反應(yīng)溫度為30℃條件下，考察超聲對丙二酸單對硝基芐酯收率和Novozym 435重復(fù)使用性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時間對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響

考察振蕩水浴和超聲作用時反應(yīng)時間對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:在25℃的振蕩水浴中，產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯收率隨著時間延長而增加，反應(yīng)8 h趨于穩(wěn)定，最大收率為38.7%。超聲作用下和振蕩水浴中，產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯收率隨時間變化趨勢基本相同。但與振動水浴相比，超聲作用下反應(yīng)5 h即達到平衡，最大收率為62.3%，提升產(chǎn)物收率的同時，有效縮短了反應(yīng)時間。

2.2 反應(yīng)溫度對丙二酸單對硝基芐酯收率影響結(jié)果

溫度是影響化學(xué)反應(yīng)的重要因素，溫度升高有利于加速反應(yīng)，但是在酶催化反應(yīng)中，溫度過高會導(dǎo)致酶變性失活。考察振蕩水浴和超聲輻照條件下，反應(yīng)溫度對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:在振蕩水浴中和超聲作用下，最佳反應(yīng)溫度分別為45和30℃。這是因為脂肪酶對溫度較為敏感，低溫不利于酶活的發(fā)揮，產(chǎn)物收率較小;高溫致使脂肪酶失活，產(chǎn)物收率下降較明顯。在超聲輔助條件下，當(dāng)溫度超過40℃時，丙二酸單對硝基芐酯收率下降較為顯著。這可能是因為高溫條件利于超聲空化作用的發(fā)生，劇烈的空化作用破壞了脂肪酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致其催化活力下降，產(chǎn)物收率降低［14］。因此，后續(xù)超聲輔助酶促酯化反應(yīng)都在30℃下進行。

2.3 對硝基芐醇濃度對丙二酸單對硝基芐酯收率影響

在對硝基芐醇和丙二酸摩爾比為1∶1、4.0 g/L Novozym 435條件下，考察超聲作用下和振蕩水浴中底物對硝基芐醇濃度對酶促酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:在振蕩水浴中，當(dāng)對硝基芐醇質(zhì)量濃度為6.0 g/L時，丙二酸單對硝基芐酯收率達到最大值62.4%。劉輝等［15］研究表明，對硝基芐醇對酶促酯化反應(yīng)有促進作用，而酸對酶促酯化反應(yīng)起抑制作用。因醇酸摩爾比固定，增加對硝基芐醇濃度，丙二酸濃度隨之增大，過高濃度的丙二酸降低反應(yīng)體系的pH，導(dǎo)致脂肪酶的活性降低，抑制酶促反應(yīng)的進行，丙二酸單對硝基芐酯收率降低。在超聲輔助酶促酯化反應(yīng)過程中，對硝基芐醇質(zhì)量濃度為4.0 g/L時，產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯收率達到最大值78.1%，超聲有效強化了傳質(zhì)，增加了底物之間及底物與酶的接觸幾率，進而增加了反應(yīng)速率，且丙二酸濃度相對較低，對反應(yīng)抑制作用較弱，因此產(chǎn)物收率相對較高。

圖3 對硝基芐醇濃度對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響Fig.3 Effects of 4-nitrobenzyl alcohol concentration on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.4 Novozym 435用量對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響

作為酯化反應(yīng)的催化劑，脂肪酶濃度是影響酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素。增大脂肪酶濃度，即增大酶的活性位點與底物接觸的幾率，因此產(chǎn)物收率增大。但是，固定化酶價格相對較高，因此在酶促酯化反應(yīng)中需綜合考慮其成本。對超聲輔助和振蕩水浴中酶促酯化反應(yīng)的催化劑Novozym 435濃度進行了優(yōu)化，結(jié)果見圖4。由圖4可知:在振蕩水浴中和超聲作用下，Novozym 435質(zhì)量濃度分別為4.5和3.0 g/L時，丙二酸單對硝基芐酯收率達到穩(wěn)定。說明該濃度下的固定化脂肪酶分子周圍的底物濃度已達到平衡，繼續(xù)增加其濃度，對反應(yīng)平衡影響較小;超聲作用的傳質(zhì)效果高于振蕩作用，有效增大了酶與底物的接觸幾率，因而在提升產(chǎn)物收率的同時減少了脂肪酶用量，節(jié)約了反應(yīng)成本。

圖4 Novozym 435濃度對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響Fig.4 Effects of Novozym 435 concentration on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.5 超聲頻率對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響

Entezari等［16］研究認為，改變超聲頻率會改變穩(wěn)態(tài)空化泡，超聲振動過程產(chǎn)生的輻射壓力和微射流會對脂肪酶分子和酶促化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響。在超聲聲強為0.5 W/cm2時，考察超聲頻率對酶促酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知:超聲頻率較低時，丙二酸對硝基芐酯收率較高，20和24 kHz的超聲作用下酶促酯化反應(yīng)產(chǎn)物收率分別為77.1%和81.6%。超聲頻率高于28 kHz，產(chǎn)物收率隨超聲頻率的增加而減小。這可能是因為頻率增加，超聲空化氣泡的存在周期縮短，空化核來不及成長為空化泡;在低頻超聲作用下，空化泡的存在周期較長，有利于脂肪酶分子形成活性更強的空間構(gòu)象，催化活力增強，產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯的收率較高［17］。從節(jié)約成本考慮，后續(xù)實驗中選用20 kHz超聲。

圖5 超聲頻率對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic frequency on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

2.6 超聲聲強對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響

聲強是超聲酶促酶促酯化反應(yīng)的重要影響因素，超聲強度低對反應(yīng)過程傳質(zhì)促進作用小，超聲強度過高又會造成脂肪酶失活［18－19］?？疾斐晱姸葘ovozym 435催化酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。超聲強度采用量熱法測定［20］，超聲頻率為20 kHz。由圖6可知:當(dāng)超聲聲強小于0.8 W/cm2時，酯化產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯的收率隨著超聲聲強的增加而迅速增大，超聲聲強為0.8 W/cm2時達到最大值89.7%，聲強超過0.8 W/cm2，產(chǎn)物收率降低。這可能是因為適宜強度的超聲作用強化了傳質(zhì)，阻止固定化脂肪酶分子周圍形成水膜，加速酶促反應(yīng)。但是，超聲聲強過高，劇烈的超聲空化作用會破壞脂肪酶分子的空間構(gòu)象，導(dǎo)致脂肪酶蛋白的變性失活［21］，丙二酸單對硝基芐酯收率減小。

圖6 超聲聲強對丙二酸單對硝基芐酯收率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic intensity on mono-p-nitrobenzyl malonate yield

此外，固定化脂肪酶價格昂貴，重復(fù)利用可以降低酶促反應(yīng)成本。在超聲輔助酶促反應(yīng)最佳條件下，重復(fù)使用Novozym 435催化合成丙二酸單對硝基芐酯，考察超聲對固定化脂肪酶重復(fù)使用性能的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知:Novozym 435重復(fù)使用8次后，丙二酸單對硝基芐酯收率仍可達到69.3%，說明超聲輔助作用于固定化脂肪酶催化合成丙二酸單對硝基芐酯反應(yīng)較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

圖7 超聲作用對固定化脂肪酶重復(fù)使用性能的影響Fig.7 Effects of ultrasonic treatment on reusability of immobilized lipase

研究了超聲輻照作用下非水介質(zhì)中固定化脂肪酶Novozym 435催化促丙二酸和對硝基芐醇合成丙二酸單對硝基芐酯的反應(yīng)，考察了超聲作用對酶促酯化反應(yīng)的影響，對超聲作用下酶法合成反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，并與振蕩水浴條件下的酶促反應(yīng)結(jié)果進行了對比。當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃、Novozym 435質(zhì)量濃度為3.0 g/L時，對硝基芐醇質(zhì)量濃度為4.0 g/L，底物摩爾比1∶1時，在頻率為 20 kHz、聲強為0.8 W/m2的超聲作用下反應(yīng)5 h，產(chǎn)物丙二酸單對硝基芐酯最大收率為89.7%。與振蕩水浴相比，溫度降低了15℃，時間縮短了3 h，酶用量減少了1.5 g/L，而產(chǎn)物收率增加了 18.2%。超聲作用下Novozym 435重復(fù)應(yīng)用于酯化反應(yīng)8次，產(chǎn)物收率仍達到69.3%。

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