謝晶瑩馮若飛徐雷張海霞李向茸侯蘭新馬忠仁

（1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；2.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

腦心肌炎病毒VP1蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

謝晶瑩1，3馮若飛1，2徐雷3張海霞2李向茸2侯蘭新3馬忠仁2

（1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；2.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

為篩選與腦心肌炎病毒VP1蛋白相互作用的靶細(xì)胞cDNA文庫蛋白，構(gòu)建VP1蛋白的誘餌載體pDHB1-VP1。擴(kuò)增EMCV的VP1基因并克隆至pMD18-T載體中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后定向克隆至酵母雙雜交誘餌載體pDHB1。將重組pDHB1-VP1載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析，并轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株NMY51，檢測(cè)其在酵母細(xì)胞中有無表達(dá)和自激活作用。結(jié)果表明，構(gòu)建的pDHB1-VP1基因可以在酵母細(xì)胞中正確表達(dá)，產(chǎn)物大小約66 kD，而且可以與兔抗EMCV血清發(fā)生特異性結(jié)合，有較好免疫原性。成功構(gòu)建了誘餌載體pDHB1-VP1，可以在酵母細(xì)胞中表達(dá)且其對(duì)報(bào)告基因無自激活作用，可以應(yīng)用于酵母雙雜交篩選試驗(yàn)中。

腦心肌炎病毒；VP1蛋白；酵母雙雜交；誘餌蛋白

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis Virus，EMCV）是可引起心肌炎的病原體，其可感染多種動(dòng)物和人［1］。該病毒是于1945年在一只患急性致死性心肌炎黑猩猩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并首次分離得到，并在1958年確診為豬的致死性疾病病因之一［2-6］。EMCV可以造成母豬的繁殖障礙、仔豬產(chǎn)生急性致死性心肌炎，并且仔豬感染后死亡率可達(dá)100%［7，8］，鼠類對(duì)于EMCV較為敏感，死亡率接近100%，多被視為病毒傳播源頭或者中間宿主［9］。目前已有研究表明EMCV在小鼠、雞、猴、倉鼠等的胚胎細(xì)胞中生長，并能產(chǎn)生細(xì)胞病變［10］。EMCV基因組為單股正鏈RNA病毒，全長約7.8 kb，有一個(gè)較大的開放閱讀框（ORF），該閱讀框長約6 879 nt，編碼由2 292個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白［11］。EMCV的衣殼粒子有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3和VP4。其中VPl抗原性最強(qiáng)，參與病毒抗原位點(diǎn)形成、受體吸附及脫殼，還與病毒粒子表面的抗原性有關(guān)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［12］，具有重要的免疫保護(hù)作用，這可能與VP1蛋白處于病毒粒子最表面有關(guān)［13，14］。但目前關(guān)于病毒與靶細(xì)胞如何作用尚無明確的報(bào)道，其相互作用的機(jī)制機(jī)理也不明確。

本研究以VP1蛋白基因構(gòu)建誘餌載體，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選EMCV的細(xì)胞結(jié)合蛋白，以期揭示病毒與靶細(xì)胞相互作用的機(jī)制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

EMCV 毒株（PV21株，ATCC）由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞由重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；兔抗EMCV鹽析血清，由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備（制備方法參照李向茸等［15］）DUALHunter starter kit購自瑞士Dualsystems Biotech公司；培養(yǎng)基YPAD，SD/-Leu，SD/-Leu/-Trp，SD/-Leu/-Trp/-His，SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade等營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基均購自Clontech公司；限制性內(nèi)切酶Sfi I，克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；dNTP，Taq酶，10×Taq reaction buffer，病毒總RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)公司；DNA Gel Extraction Kit試劑盒購自AXYGEN公司；酵母細(xì)胞總蛋白提取試劑盒和酵母質(zhì)粒小提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank EMCV毒株（登錄號(hào)X74312）VP1基因序列設(shè)計(jì)引物，序列如下：

VP1-F：TCGCGGCCATTACGGCCGGAGTAGAA AACGCTGAA，VP1-R：TCGCGGCCGAGGCGGCCATC AAGACTCCAGCTCTCG。

引物中引入Sfi I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），這樣可以確保將目的基因定向克隆入誘餌載體pDHB1。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1.2.2 VP1 基因擴(kuò)增 參照相關(guān)的操作說明提取EMCV病毒總RNA，以兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，第一步反應(yīng)體系為dNTPs（10.0 mmol/L）2.0 μL，Oligo（dT）18（10 mmol/L）2.0 μL，RNAsafe（20×）1.0 μL，RNA模板10.0 μL，總體系15 μL進(jìn)行如下反應(yīng)：70℃ 5 min，快速冰浴3 min。待第一步反應(yīng)結(jié)束，向反應(yīng)完成的溶液中加入5×First strand Buffer 4.0 μL，0.1 mol/L DTT 1.0 μL，DEPC H2O 4.0 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，混勻各組分進(jìn)行第二步反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42℃ 1 h，95℃ 5 min。待反應(yīng)結(jié)束則得到單鏈cDNA。

以cDNA為模板擴(kuò)增VP1基因。PCR反應(yīng)體系：10×PCR reaction buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物VP1-F/VP1-R各0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，DEPC H2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃變性30 s、67℃復(fù)性45 s、72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增出兩端帶有Sfi I酶切位點(diǎn)的目的DNA片段。取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3 pMD18-T-VP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，并應(yīng)用AXYGEN膠回收試劑盒進(jìn)行DNA純化，純化后產(chǎn)物構(gòu)建入克隆載體pMD18-T，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆接種于Amp+ LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)8-10 h 后參照上海生工質(zhì)粒小提試劑盒的相關(guān)操作說明進(jìn)行大腸桿菌質(zhì)粒的提取。質(zhì)粒經(jīng)PCR及Sfi I酶切驗(yàn)證正確后送上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-VP1。

1.2.4 誘餌載體pDHB1-VP1的構(gòu)建與鑒定 將測(cè)序正確的pMD18-T-VP1質(zhì)粒以及誘餌載體質(zhì)粒pDHB1分別進(jìn)行Sfi I雙酶切，凝膠回收目的基因VP1片段以及誘餌載體片段，應(yīng)用T4連接酶對(duì)載體及擴(kuò)增片段進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取陽性單克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)增及質(zhì)粒提取。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海生工生物有限公司測(cè)序，確定pDHB1-VP1誘餌載體構(gòu)建成功。

1.2.5 誘餌載體pDHB1-VP1轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株NMY51 參照Dualsystems公司酵母雙雜交試驗(yàn)說明書以TE/LiOAc法制備酵母菌NMY51細(xì)胞。

向預(yù)冷的EP管中分別加入1.5 μg誘餌質(zhì)粒DNA，5 μL預(yù)變性carrier DNA，100 μL制備好的酵母菌感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻；EP管中再加入300 μL PEG/LiOAc，輕輕混勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min（每隔10 min輕微震蕩混勻1次細(xì)胞）；向管中加入20 μL DMSO，輕微混勻，置于42℃水浴中熱激15 min（每隔5 min輕微震蕩混勻一次細(xì)胞）；12 000 r/min高速離心15 s，倒掉上清；向細(xì)胞沉淀中加入1 mLYPAD培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30℃，220 r/min搖床震蕩培養(yǎng)90 min；培養(yǎng)后的酵母菌懸液12 000 r/min高速離心15 s，倒掉上清，用0.9% NaCl溶液重懸細(xì)胞；吸取100 μL涂于直徑為100 mm的SD/-Leu固體選擇培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3-5 d至長出紅色菌落；挑取數(shù)個(gè)單克隆進(jìn)行SD-leu液體培養(yǎng)，參照北京莊盟酵母質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取，PCR進(jìn)一步確認(rèn)誘餌質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化入酵母報(bào)告株NMY51。

1.2.6 誘餌載體pDHB1-VP1在酵母細(xì)胞中的表達(dá) 將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP1的NMY51酵母菌克隆于10 mL SD/-Leu 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)至OD6000.6-1.0。參照酵母細(xì)胞總蛋白提取試劑盒相關(guān)操作說明提取總蛋白，分別進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blotting 分析。方法如下：將提取的蛋白與與2×上樣緩沖液等體積混合后上樣，電泳后考馬斯亮藍(lán)R250染色；將SDS-PAGE的膠濕轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上，一抗為兔抗EMCV鹽析血清，二抗為山羊抗兔的辣根過氧化物酶復(fù)合物，應(yīng)用DAB試劑盒顯色。

1.2.7 誘餌載體pDHB1-VP1功能驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP1的NMY51酵母菌應(yīng)用TE/LiOAc法制備感受態(tài)細(xì)胞，分別將pOst-NubI和pPR3-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入NMY51感受態(tài)細(xì)胞，方法同1.2.5所述。酵母菌液分別涂布SD/-Leu/-Trp，SD/-Leu/-Trp/-His， SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade不同營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況，檢測(cè)VP1蛋白能否在酵母細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 VP1基因的擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳時(shí)，出現(xiàn)一條特異性區(qū)帶，位于分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)800 bp附近，與預(yù)期的片段大?。?24 bp）一致（圖 1）。

圖1 VP1基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 誘餌載體pDHB1-VP1的構(gòu)建及鑒定

挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Sfi I雙酶切后，可見800 bp附近的插入片段，提示重組質(zhì)粒含有VP1基因（圖2），測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的EMCV VP1 基因堿基序列一致。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖

2.3 pDHB1-VP1轉(zhuǎn)化酵母菌NMY51

轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP1的酵母菌株NMY51在SD/-Leu培養(yǎng)基上長出紅色菌落（圖3），而未轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的NMY51酵母菌在SD/-Leu平板上無菌落生長。隨機(jī)挑取4個(gè)菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，凝膠電泳可以看到擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小正確（圖4），表明質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化進(jìn)了酵母報(bào)告株NMY51中。

圖3 誘餌載體pDHB1-VP1轉(zhuǎn)化NMY51 SD/-Leu平板上生長克隆

圖4 誘餌載體pDHB1-VP1轉(zhuǎn)化NMY51酵母菌后菌落PCR驗(yàn)證

2.4 pDHB1-VP1在酵母細(xì)胞中的表達(dá)

成功轉(zhuǎn)化pDHB1-VP1誘餌載體的陽性菌在約66 kD 處有一條帶，空載體陰性對(duì)照菌未見該條帶；陽性菌表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blotting分析及DAB顯色后，顯棕色結(jié)果（圖5），證明表達(dá)產(chǎn)物具有天然VP1蛋白的免疫原性，能被兔抗EMCV的血清所識(shí)別。

圖 5 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blotting 圖

2.5 pDHB1-VP1功能驗(yàn)證

將誘餌質(zhì)粒分別與pOst1-NubI 、pPR3-N 共轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告株NMY51，誘餌質(zhì)粒上含有泛素C末端編碼序列，pOst1-NubI 質(zhì)粒上含有泛素 N 末端序列，若誘餌質(zhì)粒正確表達(dá)，完整的泛素蛋白將在酵母細(xì)胞內(nèi)形成，啟動(dòng)報(bào)告基因的翻譯，在酵母缺陷平板上長出菌落；pPR3-N 質(zhì)粒上的泛素N 末端序列已被突變，與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后不能在酵母細(xì)胞內(nèi)翻譯為泛素蛋白。

由誘餌質(zhì)粒功能性驗(yàn)證試驗(yàn)（圖6）可以看到，pDHB1-VP1+pOst1-NubI 在SD-D、SD-T和SD-Q 平板上均有大量白色菌落長出，pDHB1-VP1+pPR3-N只在SD-D 平板上有紅色菌落長出，在SD-T和SD-Q平板上無明顯菌落生長，說明誘餌質(zhì)粒功能正常，對(duì)報(bào)告基因無自激活作用，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與VP1相互作用的靶細(xì)胞的蛋白。

圖6 誘餌質(zhì)粒功能驗(yàn)證

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)可以檢測(cè)兩個(gè)獨(dú)立的蛋白是否可以發(fā)生相互作用，此外，也利用該系統(tǒng)在蛋白文庫中篩選與已知蛋白相互作用的蛋白［16-18］。Huang等［19］利用酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建了丙肝病毒F蛋白誘餌質(zhì)粒，從人肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選出了細(xì)胞結(jié)合蛋白。Regan 等［20］應(yīng)用分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，以HPV16E5蛋白為誘餌，篩選 Hela 細(xì)胞cDNA 文庫，得到 HPV16E5的一個(gè)新的相互作用蛋白 B-cell-associated protein 31（Bap31）。

病毒感染細(xì)胞主要經(jīng)過吸附，穿入與脫殼，合成，組裝和釋放等步驟，這些步驟是病毒與細(xì)胞蛋白相互作用的結(jié)果。EMCV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1，VP2和VP3在病毒感染及宿主識(shí)別過程中起著極為重要的作用［21］。這些蛋白中僅出現(xiàn)一個(gè)氨基酸突變就能對(duì)病毒的致病性產(chǎn)生重要影響［22］。本試驗(yàn)以VP1基因構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化NMY51之后，其可在細(xì)胞中正常表達(dá)，產(chǎn)物大小約66 kD，而且有較好的免疫原性。同時(shí)誘餌質(zhì)粒對(duì)報(bào)告基因無自激活作用，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與VP1相互作用的蛋白，為尋找EMCV細(xì)胞結(jié)合蛋白奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了pDHB1-VP1酵母雙雜交誘餌載體，轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株NMY51后，其可在細(xì)胞中正常表達(dá)，同時(shí)誘餌質(zhì)粒對(duì)報(bào)告基因無自激活作用，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction and Identification of Bait Vectors with VP1 Gene of Encephalomyocarditis Virus in Yeast Two-hybrid System

Xie Jingying1，3Feng Ruofei1，2Xu Lei3Zhang Haixia2Li Xiangrong2Hou Lanxin3Ma Zhongren2
（1. Key Bio-engineering and Technology Laboratory of the Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030；2.Gansu Engineering Research Center for Animal Cell，Lanzhou 730030；3. Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030）

Bait vector pDHB1-VP1 was constructed for screening cellular proteins interacting with VP1 protein of encephalomyocarditis virus from yeast two-hybrid cDNA library of target cells in this study. VP1 gene was amplified and cloned into pMD18-T vector. After being verified by sequencing， it was directional cloning into bait vector pDHB1 of yeast two-hybrid system. Then the recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequencing and transformed into yeast cells NMY51.The bait vectors’ expression and self-activation to reporter genes were tested.The results showed that the bait plasmid pDHB1-VP1 could express in yeast cells， and product size was 66 kD. It was specific binding with rabbit anti EMCV serum， which showed better immunogenicity. Bait plasmid pDHB1-VP1 was successfully constructed， could express in yeast cells and proved to be no self-activation to reporter genes.It could be used in the yeast two-hybrid system screening test.

encephalomyocarditis virus；vp1 protein；yeast two-hybrid；bait

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.030

2014-09-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460665，31160033），教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目（IRT13091），西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（ycx13180）

謝晶瑩，女，碩士研究生，E-mail：xjy_1314@126.com

馬忠仁，男，教授，研究方向：人畜共患??；E-mail：mazhongren@xbmu.edu.cn