何蔚葒安明理陳國參賈彬，3吳曉磊王亞南

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責任公司，河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008；2.北京大學(xué)工程學(xué)院，北京 100871；3.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518060）

血液桿菌Haematobacter sp. 細胞脂肪酸測定的影響因素

何蔚葒1安明理1陳國參1賈彬1，3吳曉磊2王亞南1

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責任公司，河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008；2.北京大學(xué)工程學(xué)院，北京 100871；3.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518060）

應(yīng)用美國MIDI公司Sherlock MIS系統(tǒng)檢測一株歸屬于血液桿菌屬的新菌種Haematobacter sp. HNMC11807的細胞脂肪酸組成，探討不同培養(yǎng)方法和條件對其細胞脂肪酸組成的影響。采用不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)微生物細胞，即不同的培養(yǎng)基組成、固液類型和培養(yǎng)時間；分析比較細胞脂肪酸檢測結(jié)果存在的差異。同時對比分析儀器專用的兩種檢測體系，即常規(guī)標準和快速標準體系，對樣品脂肪酸測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞脂肪酸組成與其培養(yǎng)條件密切相關(guān)，且差異顯著。因此，在應(yīng)用該系統(tǒng)做微生物分類鑒定時，必需嚴格遵守特定的、統(tǒng)一的培養(yǎng)條件平行進行。

細胞脂肪酸檢測；培養(yǎng)基條件；脂肪酸標準品；血液桿菌

微生物細胞的脂肪酸組成與DNA具有高度的同源性，不同屬種的微生物具有不同的脂肪酸指紋圖譜［1］。Able等［2］（1963年）提出細菌脂肪酸的分析可以應(yīng)用于細菌的系統(tǒng)分類鑒定；Oyama（1963年）采用氣液色譜法（Gas Liquid Chromatography，GLC）應(yīng)用于微生物細胞脂肪酸的測定。由于GC法可檢測成分比濃度在ng（10-9）甚至pg（10-12）含量［3，4］，具有較高的靈敏度，因此，該項檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于細菌的鑒定和辨別［5］。Sherlock MIS 系統(tǒng)是美國MIDI 公司成功開發(fā)的一套自動化分析細胞脂肪酸的微生物鑒定系統(tǒng)，使脂肪酸檢測結(jié)果更加快捷準確，并且，檢測結(jié)果可與系統(tǒng)內(nèi)數(shù)據(jù)庫進行快捷比對分析，以判別微生物細胞的種屬。

大量的報道顯示，微生物細胞生長過程中，細胞脂肪酸組成呈動態(tài)變化，多數(shù)報道認為，細胞中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸組成，隨細胞生長環(huán)境條件，如溫度、pH或各種生長因子存在狀況的變化，以及生長期等發(fā)生改變［6-9］。為避免培養(yǎng)條件和提取脂肪酸操作過程引起檢測結(jié)果的波動，提高細胞脂肪酸檢測結(jié)果應(yīng)用于分類鑒定的準確性，使測定結(jié)果與系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的比對具有嚴謹?shù)姆治鲆饬x，MIDI 公司為脂肪酸鑒定系統(tǒng)制定了一套嚴格的操作規(guī)范，從培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的標準化，到細胞脂肪酸提取處理過程的標準化。盡管如此，在實際試驗過程中，仍會出現(xiàn)一些與標準要求有偏差的操作［10，11］，比如生長期較長的細胞、固態(tài)培養(yǎng)基難以生長的細胞、標準培養(yǎng)基中不生長的細胞等［12］。本研究嘗試在一株歸屬為血液桿菌屬的新菌種Haematobacter sp. HNMC11807的鑒定中，采用不同的試驗條件和方法對比細胞脂肪酸的檢測結(jié)果，探討更為有效的、更具有可比性的細菌脂肪酸的檢測方法和條件，旨在為細胞脂肪酸檢測體系應(yīng)用于微生物的系統(tǒng)分類與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 一株分離自油田采油回注水的微生物菌株，編號HNMC11807（北京大學(xué)供試菌株）。依據(jù)該菌株細胞16S rDNA序列比對分析結(jié)果，應(yīng)歸屬于Haematobacter（血液桿菌屬）的一個新物種，即Haematobacter sp. HNMC11807。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

1.1.2.1 細胞培養(yǎng)基 菌株活化和傳代培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g NaCl，1 000 mL H2O，pH7.0；其中有機類試劑采用安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品）。脂肪酸測定采用TSB（Tryptone Soy Broth）培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）和E2216培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。試驗中的TSA培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基加入瓊脂后的固體培養(yǎng)基。

1.1.2.2 脂肪酸提取用試劑 溶液I：45 g NaOH，150 mL甲醇，150 mL超純水；溶液II：325 mL HCl（6.0 mol/L），275 mL甲醇；溶液III：200 mL己烷，200 mL甲基三丁基乙醚；溶液Ⅳ：10.8 g NaOH，900 mL超純水。

1.2 方法

1.2.1 細菌細胞脂肪酸的提取［13］按照 MIDI 公司微生物鑒定系統(tǒng)的操作步驟。TSA（TSB加入瓊脂）培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)（設(shè)定的溫度和培養(yǎng)時間）的待測菌株細胞。刮取 20-40 mg 菌體，置于試管，加入 1 mL 溶液Ⅰ，充分振蕩后，＞95℃水浴30 min；冰水迅速冷卻，加入2 mL 溶液Ⅱ，振蕩混勻后80℃水浴10 min；冰水迅速冷卻，加入1.25 mL溶液III，上下顛倒10 min，靜置分層后，吸取液相上層部分；加入3 mL溶液Ⅳ，上下顛倒5 min，2 000 r/min離心3 min，靜置吸取上層液體于GC樣品瓶中，4℃放置待測。

1.2.2 脂肪酸成分檢測 采用美國 Agilent 6850 N型氣相色譜系統(tǒng)，包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器；通過細菌細胞脂肪酸成分進行細菌鑒定的分析軟件采用Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System） 和LGS4.5（Library Generation Software）（均為美國MIDI公司產(chǎn)品）。在下述氣相色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標樣和全細胞脂肪酸待檢樣本，分析條件為：柱箱溫度 170℃起，升至310℃穩(wěn)定；檢測器溫度300℃；進樣口溫度250℃，常規(guī)標準壓力10 psi，快速標準27.3 psi；載氣為氫氣（30 mL/min）、尾吹氣為氮氣（30 mL/min）；進樣量為常規(guī)標準1 μL，快速標準5 μL。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基組成類型對細胞脂肪酸組成的影響

按照MIDI公司脂肪酸測定體系應(yīng)采用TSA培養(yǎng)基，而該菌株歸屬的Haematobacter菌屬的模式菌株Haematobacter massiliensis（馬賽血液桿菌）細胞的脂肪酸測定采用E2216培養(yǎng)基。本試驗采用TSA和E2216培養(yǎng)基平行進行菌株HNMC11807細胞培養(yǎng)與脂肪酸提取和檢測，分析不同培養(yǎng)基組成對培養(yǎng)細胞的脂肪酸組成影響。結(jié)果（表1）顯示，細胞中含量最高的長鏈脂肪酸（18：1 ω7c）差異最顯著。數(shù)據(jù)庫比對分析也顯示出不同聚類結(jié)果，因此，不同培養(yǎng)基成分對細胞脂肪酸組成具有顯著影響。

表1 菌株HNMC11807于28℃培養(yǎng)48 h細胞脂肪酸測定結(jié)果

2.2 培養(yǎng)基固液類型對細胞脂肪酸組成的影響［14］

按照MIDI公司脂肪酸測定體系應(yīng)采用固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)并獲得菌體細胞。但有些微生物細胞適合液體培養(yǎng)，而在固體培養(yǎng)基中生長很差，難以在規(guī)定的時間內(nèi)生長至穩(wěn)定期、獲得足夠量的細胞。由于液體培養(yǎng)基比較適合微生物細胞生長過程中的各種生理生化水解反應(yīng)，更有利于多數(shù)微生物細胞的生長繁殖，因此，細胞生長速度在液體培養(yǎng)基中可能高于在固體培養(yǎng)基中，從而造成細胞脂肪酸組成的差異。本試驗采用E2216的液體和固體培養(yǎng)基平行進行菌株HNMC11807細胞培養(yǎng)與脂肪酸提取和檢測，結(jié)果見表2。據(jù)資料報道，隨著細胞生長過程中，長鏈脂肪酸的積累逐漸增加，短鏈脂肪酸則相反［15］。表2顯示，液體培養(yǎng)顯著高于固體培養(yǎng)細胞的長鏈脂肪酸含量，這一結(jié)果可能與細胞的生長速度有關(guān)，即液態(tài)培養(yǎng)細胞生長速度較快。

表2 菌株HNMC11807于E2216培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48 h細胞脂肪酸測定結(jié)果

2.3 培養(yǎng)時間對細胞脂肪酸組成的影響

已有的研究結(jié)果表明，微生物細胞生長初期小分子脂肪酸含量較高，隨培養(yǎng)時間延長，大分子脂肪酸逐漸增加并積累，不同生長期的微生物細胞脂肪酸組成呈動態(tài)變化。在MIDI系統(tǒng)的標準檢測中，為排除培養(yǎng)時間對細胞脂肪酸組成的影響，一般要求培養(yǎng)時間為2 d。本試驗為探討細胞培養(yǎng)時間對細胞脂肪酸組成的影響，采用E2216固體培養(yǎng)基，平行進行菌株HNMC11807細胞48 h和72 h培養(yǎng)與脂肪酸提取和檢測。結(jié)果（表3）顯示，細胞培養(yǎng)時間延長，其細胞長鏈脂肪酸含量顯著增加，與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致。因此，細胞生長期對脂肪酸組成的檢測結(jié)果有顯著的影響，不同培養(yǎng)時間的細胞脂肪酸組成檢測結(jié)果不具有嚴格的可比性。

表3 菌株HNMC11807于E2216培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)細胞脂肪酸測定結(jié)果

2.4 檢測器進樣量對細胞脂肪酸組成的影響

MIDI公司脂肪酸測定體系設(shè)置了兩種標準品的檢測項，即常規(guī)檢測標準品和快速檢測標準品，兩種標準品的脂肪酸組成配置沒有顯著差別（表4），但在進樣量方面，快速檢測體系高于常規(guī)檢測體系5倍；在檢測時間方面，快速檢測體系柱分析時間低于常規(guī)檢測體系。由于進樣量的增加，快速檢測體系可以提高樣品的可檢測性，對檢測結(jié)果的影響需探討確認。本試驗將菌株HNMC11807于E2216固體培養(yǎng)基28℃、48 h培養(yǎng)，提取并采用不同的檢測體系和標準品檢測細胞脂肪酸組成，對比分析兩種檢測體系的測定，結(jié)果（表5）顯示，由于進樣量的提高，快速檢測體系能夠檢測到更多微量成分（如含量＜1%的脂肪酸）。但是，對比分析具有可比性意義的脂肪酸檢測結(jié)果（即含量＞1%-5%的脂肪酸），發(fā)現(xiàn)快速檢測體系與常規(guī)檢測體系沒有顯著的差異（表5中黑體標注的脂肪酸），同時數(shù)據(jù)庫給出的比對分析結(jié)果也非常一致。因此，在實際檢測中兩種體系均可以使用，只是跨體系的檢測結(jié)果比較時存在微小的誤差。建議作為新菌種鑒定指標比對分析數(shù)據(jù)時，最好在相同的檢測體系下完成。

表4 2種標準品脂肪酸組成的檢測結(jié)果

表5 菌株HNMC11807于E2216固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48 h細胞脂肪酸測定結(jié)果

2.5 不同處理條件對細胞脂肪酸含量影響強度對比

綜上可知，不同處理方法對細胞脂肪酸組成有不同程度的影響，針對本試驗的菌株Haematobacter sp. HNMC11807的脂肪酸測定結(jié)果對比（表6）表明，對細胞脂肪酸影響的幅度分別為細胞培養(yǎng)時間＞液體培養(yǎng)基培養(yǎng)＞不同成分培養(yǎng)基培養(yǎng)＞＞檢測體系差別，進一步分析認為，在同一溫度條件下，細胞的菌齡是影響細胞脂肪酸組成的關(guān)鍵因素。我們認為，以MIDI分析系統(tǒng)測定的細胞脂肪酸數(shù)據(jù)為分類學(xué)依據(jù)時，除了兩種標準品應(yīng)用對檢測體系影響較低外，其它不同處理條件的結(jié)果間差異非常顯著，分析時必需采用完全一致的條件平行培養(yǎng)和處理細胞，否則其脂肪酸檢測結(jié)果不具有分類學(xué)意義上的可比性。

表6 不同處理條件對細胞脂肪酸含量測定結(jié)果的影響幅度

3 討論

通過對歸屬于血液桿菌屬的一個新物種Haematobacter sp. HNMC11807細胞脂肪酸檢測分析，探討了培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基固液類型、培養(yǎng)時間對細胞脂肪酸組成的影響，同時還探討了兩種檢測體系獲得的細胞脂肪酸檢測結(jié)果的可比性，發(fā)現(xiàn)細胞的生長期對脂肪酸的檢測結(jié)果影響最為顯著。因此，在應(yīng)用全細胞脂肪酸分析結(jié)果進行物種分類鑒定時，需要嚴格控制細胞生長期；不同培養(yǎng)基類型（組成類型和形態(tài)類型）培養(yǎng)的細胞和不同生長期的細胞，其脂肪酸的檢測結(jié)果不具有可比性，在分類鑒定中不能作為比對分析的依據(jù)。在細胞脂肪酸的氣相檢測中，采用快速檢測體系或常規(guī)檢測體系并不影響結(jié)果的正確性，但在微生物分類鑒定時，待鑒定細胞與參比細胞應(yīng)采用相同的體系檢測脂肪酸組成，以確保比對結(jié)果分析的可靠性和嚴謹性。

4 結(jié)論

微生物細胞脂肪酸的組成和含量與細胞的生境和生長階段密切相關(guān)。在細胞脂肪酸檢測和數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)重視影響細胞生長速度的各種環(huán)境條件和因素（如培養(yǎng)基組成成分、培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)溫度、時間等），嚴格同等的細胞生長條件所獲得的細胞脂肪酸的檢測數(shù)據(jù)才具有鑒定學(xué)意義的可比性。

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（責任編輯 馬鑫）

The Influence Factors of Determination of Haematobacter sp. Cellular Fatty Acids

He Weihong1An Mingli1Chen Guocan1Jia Bin1，3Wu Xiaolei2Wang Yanan1
（1. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008；2. College of Engineering，Peking University，Beijing 100871；3. College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）

Cellular fatty acid composition of strain HNMC11807， a novel species belong to Haematobacter sp.， were detected by used Sherlock MIS system of MIDI company USA. The influence by different culture methods and cells growth conditions on cells fatty acid composition were explored in this article. Based on the bacterial cells cultured in varied medium such as in different medium components and in solid or liquid medium， the cellular fatty acid composition were respectively analysed and compared. On the same time， two standard systems in this instrument， conventional and fast， were used to run samples， and the detect results of the cellular fatty acid composition were compared respectively. As the results， the cells fatty acid composition was closely related with culture condition and a significant differences. The cellular fatty acid composition must be carried out in specified and unified culture conditions when this system was used in microbial classification.

determination of cells fatty acids；condition of medicum；standards of fatty acids；Haematobacter sp.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.032

2014-10-04

國家自然科學(xué)基金項目（31100582），河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目（102300413217）

何蔚葒，女，高級實驗師，研究方向：微生物系統(tǒng)分類與鑒定；E-mail：heweihong-70@163.com

王亞南，女，博士，副研究員，研究方向：環(huán)境微生物菌種資源開發(fā)與應(yīng)用；E-mail：wangyanan@mail.tsinghua.edu.cn