薛春霞等

摘要：使用電化學聚合法在碳糊電極（CPE）的表面制備了血紅蛋白分子印跡聚合物膜，并對其制備條件進行了優(yōu)化。結果表明，電聚合過程中掃描速度為0.05 V/s、聚合圈數(shù)為5、單體濃度為0.5 mol/L、交聯(lián)劑濃度為0.10 g/mL時制備的修飾電極在循環(huán)伏安法鐵化氰鉀中的還原峰電流最弱，說明修飾電極的負載量達到最大。

關鍵詞：分子印跡聚合物；血紅蛋白；電化學傳感器

中圖分類號：O657.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.048

The Preparation of Biological Macromolecules Imprinted Polymer

XUE Chun-xia1， LI Jing2， ZHANG Xiao-ran3

（1.Chutian College of Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430205， China；

2. Xi'an University of Arts and Science， Xi′an 710065， China； 3. Xi'an University of Architecture and Technology， Xi′an 710055， China）

Abstract： Hemoglobin molecularly imprinted polymer membranes on the surface of carbon paste electrode （BHb/MIP-CPE） was prepared by electrochemical polymerization， and the preparation conditions were optimized. The results showed that the electrochemical polymerization of scan rates of 0.05 V/s， cycles for 5 times， the concentration of monomer（AM） for 0.5 mol/L and the concentration of cross linking agent（MBA） for 0.01 g/mL were optimization for reduction peak current of the modified electrode in 5.0 mM K3Fe（CN）6 of cyclic voltammograms， which indicated the modified electrode capacity reached the highest.

Key words： imprinted polymer； hemoglobin； electrochemical sensors

分子印跡聚合物對模板分子的立體結構具有“記憶”功能，從而對模板表現(xiàn)出高度選擇性識別能力。依據(jù)功能單體和模板分子的作用機理不同，分子印跡可分為共價印跡和非共價印跡兩大類。前者是模板分子與功能單體先通過共價鍵結合繼而進一步聚合進行印跡的方法；而后一種方法是基于模板分子與功能單體之間通過氫鍵、離子鍵、π堆積、范德華力等形成預組織化合物，在此基礎上進一步聚合得到印跡聚合物。鑒于分子印跡聚合物對模板的選擇性識別能力，其作為分離富集材料和傳感器的敏感元件以及催化劑等在諸多分析領域的應用前景一直備受關注[1]。然而迄今為止，有關分子印跡技術的研究大多停留在小分子的印跡上，人們在氨基酸[2，3]、金屬離子[4]、小分子藥物[5]等為模板的分子印跡研究中已經(jīng)取得長足進步。而對于生物大分子，如蛋白質的分子印跡研究還鮮有成功的范例[6-8]。應用到電極表面的生物大分子印跡聚合物的研究也極少報道。電化學分析方法具有很高的靈敏度，簡單方便，在傳感器研究中被廣泛應用為換能器。將具有特異選擇性的分子印跡聚合物與電化學分析技術相結合，可以制備出具有高選擇性和靈敏度的分子印跡電化學傳感器。本試驗將嘗試在電極表面使用電化學方法引發(fā)丙烯酰胺制備血紅蛋白分子印跡聚合物，并對印跡膜的性質、選擇性及檢測能力進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電化學工作站CHI660B（上海辰華儀器公司）；掃描電子顯微鏡Quanta600FEG（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超聲波清洗機SB4200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）；紅外干燥箱CJ-1（上虞市道墟星峰儀器廠）；電子天平ESJ60-4（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）。

牛血紅蛋白（BHb）（Sigama化學試劑公司）：溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制（0.01 mol/L，pH 7.0）；丙烯酰胺（AM）[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）（阿拉丁工業(yè)有限公司）；pH 7.0的KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液；所用其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

試驗采用循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法等電化學方法在CHI660B電化學工作站（上海辰華儀器公司）上和三電極單室電解池中進行。

碳糊電極（CPE）的制備：稱取3.4 g光譜純石墨粉和0.6 g液體石蠟置于小燒杯中，攪拌30 min，使其混合均勻呈糊狀，取適量碳糊填入經(jīng)乙醚和丙酮處理干凈的PVC塑料管中，將銅絲固定到碳糊中，再將電極表面打磨光滑。完成后將電極在PBS緩沖溶液（0.10 mol/L pH 7.0）活化掃描。

2 結果與分析

2.1 BHb分子印跡聚合物膜修飾電極的初步制備

試驗以碳糊電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。電聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液，在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.75 g AM（功能單體），0.1 g MBA（交聯(lián)劑），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引發(fā)劑），超聲波混合、溶解均勻。試驗前，上述溶液通氮氣除氧10 min，然后放入經(jīng)過預處理的碳糊電極，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循環(huán)伏安法循環(huán)掃描5圈，掃描速度為0.02 V/s。電聚合完成后在KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液中用循環(huán)伏安法檢測BHb的氧化還原峰（圖1）[9]。在（-0.2）～（-0.4）V出現(xiàn)BHb的還原峰，初步說明BHb已固定在電極表面上。為了進一步說明出現(xiàn)的峰是BHb的還原峰，特做了對比試驗。將5 mg/mL BHb溶液用微量進樣器滴涂到裸電極表面。等電極表面晾干后用同樣的方法進行檢測（圖2）。由圖2可知，在（-0.2）～（-0.4）V也同樣出現(xiàn)與電化學聚合牛血紅蛋白（BHb）一樣的還原峰。

2.2 聚合物膜制備條件的優(yōu)化

電化學聚合形成蛋白質分子印跡聚合物膜導電性很差，在本試驗中使用鐵氰化鉀分子[K3[Fe（CN）6]作為探針，來間接考察印跡膜的檢測特性。當?shù)鞍踪|分子印跡膜很好的覆蓋在電極表面時，鐵氰化鉀[K3[Fe（CN）6]的電化學信號就會很弱。反之，電化學信號會增強。所以優(yōu)化電聚合條件時，比較峰電流高低可判斷此條件下是否有利于電聚合。

2.2.1 電聚合時掃描速度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變掃描速度（0.01、0.02、0.05、0.1 V/s）電聚合到同批的不同碳糊電極上。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進行檢測（圖3）。由圖3可知，掃描速度過慢時，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脫落，電極表面不能被膜完全覆蓋，導致電化學信號增強，峰電流變大。掃描速度過快，使電極表面印記膜太致密，并且蛋白質模板深嵌在聚合物中難以洗脫。0.02 V/s到0.01 V/s這段峰電流呈下降趨勢，但因為掃速太快使膜易脫落，所以不再研究比0.01 V/s還小的掃描速度。圖3中顯示掃描速度0.05 V/s時峰電流最小，掃描速度又不是很快，所以在此掃描速度下有利于電聚合。

2.2.2 電聚合時掃描圈數(shù)的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變掃描圈數(shù)電聚合到同批的不同碳糊電極上。本試驗選擇了3、5、10、20、30圈5個掃描圈數(shù)。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進行檢測（圖4）。由圖4可知，掃描圈數(shù)過少時，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脫落，電極表面不能被膜完全覆蓋，導致電化學信號增強，峰電流變大。掃描圈數(shù)過多，使電極表面印記膜太致密，并且蛋白質模板深嵌在聚合物中難以洗脫。雖然掃描圈數(shù)為30圈時峰電流還是呈下降趨勢，但因為其圈數(shù)太多，導致模板難洗脫，所以不再研究30圈以上的圈數(shù)。圖4中顯示在5圈時峰電流最低下，所以在此圈數(shù)下有利于電聚合。

2.2.3 電聚合時單體丙烯酰胺濃度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變單體濃度電聚合到同批的不同碳糊電極上。單體初始濃度常選用0.5 mol/L，本試驗選擇了0.24、0.50、1.05、1.20、1.43 mol/L 5個單體濃度進行優(yōu)化。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進行檢測（圖5）。由圖5可知，電聚合時單體濃度過低，導致聚丙烯酰胺斷鏈或鏈過短而無法包裹住模板分子使電極表面無法完全被電聚合膜覆蓋。單體濃度在0.5 mol/L時電化學信號最弱，所以在此濃度下有利于電聚合。

2.2.4 電聚合時交聯(lián)劑濃度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變交聯(lián)劑濃度電聚合到同批的不同碳糊電極上。試驗選擇了0.05、0.10、0.20、0.30 g/mL 4個不同濃度，待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進行檢測。交聯(lián)劑的作用是使模板分子和功能單體形成高度交聯(lián)、剛性的高分子聚合物，保持其三維空穴，不致于在洗脫、吸附模板分子的過程中空穴結構坍塌或變形，能保持原空穴的空間結構和識別位點的穩(wěn)定。交聯(lián)劑濃度不能過高，濃度過高會使空穴失去柔性，不利于洗脫（圖6）。由圖6可知，峰電流隨著交聯(lián)劑質量增大而降低，但在聚合過程中交聯(lián)劑超過0.10 g/mL時，聚合液極易固化使電聚合不能正常進行。所以0.10 g/mL交聯(lián)劑更有利于電聚合。

綜上所述，按照以上優(yōu)化條件制備出來的印記膜均勻、致密、印跡效果好。試驗應以鉑電極為對電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，以碳糊電極作為工作電極。電聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.5 mol/L AM（功能單體），0.10 g/mL MBA（交聯(lián)劑），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引發(fā)劑），超聲波混合、溶解均勻。試驗前上述溶液通氮氣除氧10 min，然后放入經(jīng)過預處理的碳糊電極，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循環(huán)伏安法循環(huán)掃描5圈，掃描速度為0.05 V/s。試驗完畢后，將電極用去離子水沖洗干凈，先放入AcOH和SDS的混合液（AcOH 10%，SDS 10%）中洗脫2 h，然后放入0.5 mol/L H2SO4中洗脫l h，洗去模板分子，最后放入磷酸緩沖溶液中平衡30 min。對照電極的制備與上述過程相同，只是聚合液體中不加模板分子。

3 小結

在分子印跡技術中，選擇合適的功能單體與模板分子鍵合是印跡過程非常重要的環(huán)節(jié)。丙烯酰胺及其衍生物類單體己被廣泛研究和應用于水環(huán)境下分子印跡聚合物的合成，特別是蛋白質分子的印跡[10]。試驗中，丙烯酰胺作為功能單體與蛋白質分子通過非共價鍵結合，圍繞在蛋白質分子周圍，形成特定的空間構型，聚合反應發(fā)生后，這種構型就會被保存下來。試驗得出，電聚合過程中掃描速度為0.05 V/s、聚合圈數(shù)為5、單體濃度為0.5 mol/L、交聯(lián)劑濃度為0.10 g/mL時制備的修飾電極在循環(huán)伏安法鐵氰化鉀中的還原峰電流最弱，說明修飾電極的負載量達到最大。在常規(guī)的化學方法制備聚丙烯酰胺中，一般使用氧化還原引發(fā)體系進行引收。本試驗中，丙烯酰胺的聚合也是氧化還原引發(fā)過程，氧化劑是K2S2O8，還原劑是施加負電位的“電極”。當電極施加足夠負的低電位時，K2S2O8首先被還原為陰離子自由基，該自由基再進而引發(fā)丙烯酰胺的聚合。上述反應方程式反應歷程可以表示為：

S2O82-+e-→SO42-+SO4-

在交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）的作用下，聚丙烯酰胺在電極表面形成高交聯(lián)度，結構致密的聚合物；如果聚合液體中含有蛋白質模板分子，模板分子會隨著聚合物的形成一同印跡鑲嵌在聚合物骨架中。

參考文獻：

[1] 丁 超，曹姍姍.分子印跡技術在新領域的進展[J].化學工程與裝備，2012（11）：155-156.

[2] 徐 雯，李 曉，張衛(wèi)英，等.L-色氨酸分子印跡傳感器敏感膜的制備與性能[J].高等學校化學學報，2012，33（10）：2199-2204.

[3] 趙 碩，崔莉鳳，申 晴.谷氨酸分子印跡電化學傳感器的研究[J].環(huán)境科學與技術，2012，35（11）：70-74.

[4] 李建玲，高 飛，張雅琨，等.Schiff堿基過渡金屬鎳絡合物的電化學聚合：陽極電聚合中掃描速率的影響[J].物理化學學報，2010，26（10）：2647-2652.

[5] 郝明燕.紅霉素分子印跡聚合物膜的制備及性能研究[D].西安：西北工業(yè)大學，2007.

[6] 周艷梅，徐文國，童愛軍.硅膠表面牛血清白蛋白分子印跡聚合物的制備及分子識別性能[J].分析化學研究報告，2006，34（11）：1551-1554.

[7] 孫瑞豐，羅 暉，于慧敏，等.人血紅蛋白分子印跡聚合物的制備及分子識別性能[J].過程工程學報，2005，5（3）：341-344.

[8] 劉 凱.新型分子印跡電化學傳感器的研制及蛋白質直接電化學研究[D].長沙：湖南大學，2007.

[9] 史傳國，衡姝婧，徐靜娟，等.基于血紅蛋白/硒化鎘量子點多層膜的H2O2生物傳感器[J].無機化學學報，2009，25（9）：1526-1531.

[10] 高 娜.分子印跡技術在蛋白質識別中的應用進展[J].化學研究與應用，2009，24（3）：337-343.