ELISA檢測試劑盒在出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用與質(zhì)控

魏海燕 曾靜 張偉 劉建禮 梁新苗 李東燕 劉來福

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026）

ELISA檢測試劑盒在出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用與質(zhì)控

魏海燕 曾靜 張偉 劉建禮 梁新苗 李東燕 劉來福*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026）

介紹了ELISA檢測試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用情況、面臨的問題及當(dāng)前的監(jiān)管現(xiàn)狀，并探討了ELISA檢測試劑盒的質(zhì)控評價方法。

ELISA；試劑盒；檢驗(yàn)檢疫；應(yīng)用；質(zhì)控

1 前言

自從Engvall和Perlmann（1971）首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)［1］（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）以來，隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實(shí)用，尤其是商品化ELISA檢測試劑盒的問世，進(jìn)一步推動了檢測領(lǐng)域自動化、標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的發(fā)展進(jìn)程，使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品安全檢測、出入境檢疫、環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域。

2 ELISA檢測試劑盒在我國出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中的應(yīng)用概況

目前ELISA檢測試劑盒在我國出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用范圍覆蓋食品安全檢測、動物檢疫、植物檢疫和衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。如食品安全檢測領(lǐng)域針對食品中的過敏原、維生素、轉(zhuǎn)基因成分、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、生物毒素、致病微生物檢測的ELISA試劑盒；動物檢疫方面豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的ELISA檢測試劑盒；植物檢疫中針對植物病毒、細(xì)菌、真菌、植物激素進(jìn)行檢測的ELISA試劑盒；衛(wèi)生檢疫中細(xì)胞因子檢測試劑盒、內(nèi)分泌檢測試劑盒、自身免疫檢測試劑盒、傳染病檢測試劑盒、特種蛋白檢測試劑盒、腫瘤標(biāo)志物檢測試劑盒等?？梢?，ELISA檢測試劑盒已成為國境檢驗(yàn)檢疫安全偵檢技術(shù)體系中的重要組成，是有害生物及有毒有害物質(zhì)檢測不可或缺的重要技術(shù)手段，極其適合出入境檢驗(yàn)檢疫對大量樣品快速篩查的需求。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國出入境檢驗(yàn)檢疫中應(yīng)用的ELISA檢測試劑盒多達(dá)200余種，尤其在動物檢疫領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛。

出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域所涉及的ELISA試劑盒根據(jù)其所用的固相載體可區(qū)分為3大類型：①采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA試劑盒，即通常所指的微量板ELISA試劑盒，也是目前應(yīng)用最多的一種；②用硝酸纖維膜為載體的ELISA試劑盒，又稱斑點(diǎn)ELISA試劑盒；③采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA試劑盒，稱為布ELISA試劑盒。在微量板ELISA試劑盒中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA試劑盒、雙抗體夾心ELISA試劑盒、雙夾心ELISA試劑盒、競爭ELISA試劑盒、阻斷ELISA試劑盒及抗體捕捉ELISA試劑盒等。此外，商品化ELISA檢測試劑盒還可分為定性檢測用與定量檢測用兩種，前者試驗(yàn)出具的檢測報告僅出具陰性與陽性的判斷結(jié)果，不報送具體檢測數(shù)值，后者試驗(yàn)出具的檢測報告報送在檢測限以上的檢測數(shù)值，當(dāng)前檢驗(yàn)檢疫中所使用的ELISA檢測試劑盒主要是定性檢測。

通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域所使用的ELISA檢測試劑盒多依賴于進(jìn)口產(chǎn)品，其生產(chǎn)商多是發(fā)達(dá)國家的一些大型老牌生物或制藥公司，如法國生物梅里埃、美國AGDIA公司、德國拜發(fā)公司等。這些進(jìn)口試劑盒價格昂貴，一個96孔ELISA檢測試劑盒通常需要5 000-6 000元，較高的檢測成本限制了檢測工作的開展和檢測技術(shù)的推廣；此外，試劑盒進(jìn)口周期一般較長，難以應(yīng)對緊急突發(fā)事件；某些試劑盒進(jìn)口渠道有限，甚至無法進(jìn)口，導(dǎo)致某些檢測項(xiàng)目只有送到國外才能確認(rèn)。盡管如此，這些試劑盒在檢測人員尤其是官方實(shí)驗(yàn)室和第三方檢測機(jī)構(gòu)中的認(rèn)同率仍然非常高。分析其原因主要是由于其可靠的質(zhì)量保障，這些產(chǎn)品在入市前大都經(jīng)過了一些官方或權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證，如AOAC、AFNOR等。與之相比，國內(nèi)ELISA檢測產(chǎn)品，大都未經(jīng)過相關(guān)組織認(rèn)證，產(chǎn)品關(guān)鍵性能指標(biāo)和穩(wěn)定性缺乏有效的數(shù)據(jù)支撐，市場占有率較低。

3國產(chǎn)ELISA檢測試劑盒在應(yīng)用中面臨的問題

近年來國產(chǎn)ELISA檢測試劑盒得到了飛速發(fā)展，應(yīng)用范圍日趨廣泛，產(chǎn)業(yè)化規(guī)模不斷擴(kuò)大，在某些領(lǐng)域甚至具有不可替代性，但同時也出現(xiàn)了一些不可忽視的隱患。首先，ELISA試劑盒的研發(fā)與生產(chǎn)成本較低，投入產(chǎn)出值較高，研發(fā)周期相對較短，一些水平低、規(guī)模小、管理差的企業(yè)也紛紛加入生產(chǎn)行列，市場上的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。其次，對ELISA檢測試劑盒缺乏完備的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系，絕大多數(shù)的ELISA檢測試劑盒處于監(jiān)管缺失狀態(tài)，產(chǎn)品市場準(zhǔn)入門檻低，一些低劣的ELISA檢測試劑盒甚至未經(jīng)方法學(xué)評價就涌入市場，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來了巨大隱患。此外，ELISA檢測試劑盒涉及抗體等生物活性分子，抗體效價高低、特異性強(qiáng)弱，穩(wěn)定性好壞都將直接影響檢測結(jié)果?？梢?，ELISA試劑盒的質(zhì)量把關(guān)是保障檢測結(jié)果的可靠性、可比性和權(quán)威性的重要前提，尤其對于“憑技術(shù)執(zhí)法、靠數(shù)據(jù)說話”的檢驗(yàn)檢疫工作而言更是有著舉足輕重的作用。選用可靠的ELISA檢測試劑盒有助于提高我國檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室的競爭力，提升政府信任度，促進(jìn)檢測結(jié)果的國際互認(rèn)，沖破國外技術(shù)壁壘，樹立我國的地位和形象，推動進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展。

國內(nèi)近幾年開始重視針對試劑盒的管理工作，如農(nóng)業(yè)部對獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行備案管理［2，3］，國家食品藥品監(jiān)督管理局對體外診斷試劑實(shí)行分類注冊管理［4，5］，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局則發(fā)布了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《商品化食品檢測試劑盒評價方法》（SN/T 2775-2011），對商品化食品安全檢測試劑盒市場準(zhǔn)入及管理方面作出了規(guī)定［6］。雖然三個部門對不同領(lǐng)域試劑盒的監(jiān)管均有涉及ELISA檢測產(chǎn)品，但尚未能建立成熟的專門針對ELISA檢測試劑盒的監(jiān)管體系，在許多領(lǐng)域仍存在監(jiān)管空白。

4 ELISA檢測試劑盒的質(zhì)量控制

ELISA檢測試劑盒的質(zhì)量控制在其生產(chǎn)和應(yīng)用中都具有重要的意義，便于ELISA檢測試劑盒生產(chǎn)企業(yè)及用戶在生產(chǎn)或使用時對相關(guān)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評價，維護(hù)產(chǎn)品質(zhì)量，了解使用該試劑盒對檢測結(jié)果的影響，保障檢測結(jié)果的可靠性。目前，國內(nèi)對ELISA檢測試劑評價方面的研究多涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，使用的方法也不盡相同［7］。而國外一些知名的國際組織或?qū)W會自20世紀(jì)80年代以來紛紛建立了較為完整的針對商品化試劑盒的評價程序，更為注重對于采用試劑盒進(jìn)行檢測時可以滿足的方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)，其中較為有名的如國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）的評價方法［8，9］。ELISA試劑盒種類繁多，技術(shù)原理多樣，在實(shí)際的驗(yàn)證工作中可根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)、應(yīng)用范圍、針對的目標(biāo)物和適用的檢測基體，綜合參考ISO、AOAC的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，從保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性入手，從檢測技術(shù)性能指標(biāo)對ELISA試劑盒進(jìn)行評價。例如，以食品中致病微生物的ELISA檢測試劑盒為例，可從以下幾個指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

4.1相對精確度、相對靈敏度、相對特異性

根據(jù)ELISA試劑盒的適用范圍和用戶自身的要求選擇需驗(yàn)證的食品種類，食品樣品的來源要盡可能廣，包括不同地域，避免地域上的偏差。如選用自然污染的樣品要盡可能代表該類食品通常的污染水平，尤其是污染范圍的低限；如果無法獲得足夠數(shù)量的自然污染樣品，也可使用人工污染的食品樣品，這種樣品污染水平應(yīng)與ELISA試劑盒提供的臨界控制值一致，以保證對于同一種樣本能有部分陽性，部分陰性的結(jié)果。每種代表性食品的測試樣品數(shù)應(yīng)達(dá)20以上，以滿足統(tǒng)計學(xué)計算要求；采用ELISA試劑盒方法和參考方法進(jìn)行同步檢測，按下表進(jìn)行計算。

表1　ELISA試劑盒方法和參考方法的檢測結(jié)果表示［8］

注：N是所有樣品數(shù)的總和（NA+PA+PD+ND）；N-是參考方法獲得的陰性結(jié)果數(shù)（NA+PD）；N+是參考方法獲得的陽性結(jié)果數(shù)（PA+ND）。

4.2相對檢測水平、與參考方法的一致性

根據(jù)ELISA試劑盒的驗(yàn)證要求，選取合適的驗(yàn)證菌株和食品種類，盡可能使每種菌伴隨一種食品類別。針對每種食品中的一個目標(biāo)菌至少檢測其3個水平：第1個水平可以是陰性對照，第2個水平應(yīng)是理論上的檢測限，第3個水平稍高于理論檢測閾值。利用ELISA試劑盒方法和參考方法對每種組合（食品類型、污染水平）都重復(fù)檢測至少6次。

對每個水平和每種食物/菌株組合，可按表2所示采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

不僅可比較ELISA試劑盒方法同參考方法用于同一食品/菌株中同一接種水平檢測時有無差異，而且可比較相同接種水平的兩種不同食品/菌株組合的檢測結(jié)果。相對檢測水平則可用檢出率剛好超過50%時所對應(yīng)的樣品污染水平來表示。

表2　相對檢測水平的計算［8］

4.3包容性和排他性

根據(jù)ELISA試劑盒的測定范圍選擇合適的目標(biāo)菌50株，另從可能對目標(biāo)菌檢測造成干擾和所驗(yàn)證食品中出現(xiàn)概率高的菌株中選擇非目標(biāo)菌至少30株。目標(biāo)菌的檢測水平要比ELISA試劑盒的相對檢測水平高10至100倍，非目標(biāo)菌的檢測水平應(yīng)與所驗(yàn)證食品中可能出現(xiàn)的最高污染水平相當(dāng)。利用ELISA試劑盒和參考方法對上述菌株的純培養(yǎng)物進(jìn)行同步檢測，比較ELISA試劑盒的包容性和排他性。

除了上述主要指標(biāo)，對定量檢測用ELISA試劑盒還應(yīng)評價其檢測范圍、檢測限、定量限、回收率等指標(biāo)，具體計算亦可參考ISO或其他官方驗(yàn)證方法［6，8］。同時，在試驗(yàn)設(shè)計上同樣應(yīng)注重對試驗(yàn)樣本的選擇，細(xì)致地劃分檢測樣本的類型，從而使得對ELISA試劑盒的評價更具科學(xué)性。

5 結(jié)語

ELISA試劑盒在我國出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景，其質(zhì)量把關(guān)是保障檢測結(jié)果的可靠性、可比性和權(quán)威性的重要前提，尤其對于“憑技術(shù)執(zhí)法、靠數(shù)據(jù)說話”的檢驗(yàn)檢疫工作而言更是有著舉足輕重的作用。建立科學(xué)規(guī)范的ELISA檢測試劑盒評價體系，加強(qiáng)使用過程中的質(zhì)量控制，可有助于提高我國檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室的競爭力，提升政府信任度，促進(jìn)檢測結(jié)果的國際互認(rèn)，沖破國外技術(shù)壁壘，樹立我國的地位和形象，推動進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展。

［1］Engvall E，Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.Quantitative assay of immunoglobulin G Immunochemistry，1971，8（9）：871-874.

［2］農(nóng)業(yè)部.關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑（盒）管理的通知［Z］.農(nóng)辦醫(yī)［2005］3號，2005.

［3］農(nóng)業(yè)部.關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》的通知［Z］.農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］17號，2005.

［4］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）的通知［Z］.國食藥監(jiān)械［2007］229號，2007.

［5］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊管理辦法［Z］.國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，2014.

［6］SN/T 2775-2011商品化食品檢測試劑盒評價方法［S］.

［7］畢勝利.ELISA檢測試劑的評價方法［D］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2006.

［8］ISO 16140：2003（E）Microbiology of food and animal feeding stuffs-Protocol for the validation of alternative methods［S］.

［9］Appendix M：Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods：Community Guidance and Best Practices.Official Methods of Analysis，19th Ed.，2012，AOAC INTERNATIONAL，Gaithersburg，MD.

Application and Quality Control of ELISA Detection Kit in Entry-Exit Inspection and Quarantine

Wei Haiyan，Zeng Jing，Zhang Wei，Liu Jianli，Liang Xinmiao，Li Dongyan，Liu Laifu*
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026）

This paper introduced the application of ELISA test kit in inspection and quarantine field，the existing problems and the present situation of supervision，and discussed the evaluation method of quality control for ELISA kit.

ELISA；Kit；Inspection and Quarantine；Application；Quality Control

R446.61

E-mail：weihy@bjciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

國家質(zhì)檢總局科技計劃項(xiàng)目（2013IK306）

2015-06-09