徐英江 任傳博 孫 巖 薛敬林 田秀慧 劉慧慧 宮向紅

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 煙臺(tái)264006; 2. 煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司, 煙臺(tái) 264006)

己烯雌酚(Diethylstilbestrol, DES)和雙烯雌酚(Dienestrol, DS)均是經(jīng)由人工合成的非甾體類雌激素, 并且雙烯雌酚經(jīng)實(shí)驗(yàn)確證為己烯雌酚的代謝物[1—3], 己烯雌酚和雙烯雌酚均具有化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、并且通過化學(xué)合成容易獲得、合成成本較低的特點(diǎn)[4,5]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 己烯雌酚的主要用途是作為添加劑加入魚類飼料中[6—9],刺激魚類正常新陳代謝, 增加魚體內(nèi)氮停留, 提高魚體內(nèi)氨基酸合成蛋白的速度, 最終達(dá)到促進(jìn)魚類生長的目的[10,11]。其中殘留在魚體內(nèi)的己烯雌酚和雙烯雌酚通過食物鏈進(jìn)入人體, 破壞人體正常生理平衡, 兩種物質(zhì)對(duì)人類的危害也被逐漸發(fā)現(xiàn), 且己烯雌酚已被證實(shí)是一種致癌物質(zhì),在體內(nèi)的長期蓄積必然嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康[12—15]。美國和歐盟已經(jīng)明令禁止使用己烯雌酚。2002年, 我國農(nóng)業(yè)部在第 193號(hào)公告中宣布停止己烯雌酚在所有食用動(dòng)物中使用[16,17]; 并在第 235號(hào)公告中規(guī)定己烯雌酚在動(dòng)物性食品中不得檢出[18], 但目前的相關(guān)法令和標(biāo)準(zhǔn)尚未制定雙烯雌酚的測定標(biāo)準(zhǔn)。

鯉作為我國重要的食用魚類, 因其營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高深受消費(fèi)者喜愛。本試驗(yàn)采用口灌給藥的方法對(duì)常規(guī)養(yǎng)殖的鯉進(jìn)行給藥, 進(jìn)一步研究了兩種物質(zhì)在鯉體內(nèi)不同組織中的分布情況以及相關(guān)藥物代謝參數(shù)。本試驗(yàn)可為己烯雌酚在其他水生生物體內(nèi)的藥物代謝提供參考, 并且可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)規(guī)范用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷為色譜純, 所用水為超純水; 碳酸鈉為分析純, 鹽酸為優(yōu)級(jí)純; 標(biāo)準(zhǔn)品己烯雌酚和標(biāo)準(zhǔn)品雙烯雌酚(純度 99.5%), 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品 D8-己烯雌酚(純度 99.5%), 上述三種標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司; 低分子量肝素鈉注射液, 5000 IU,購自杭州九源基因工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(TSQ Vantage, Thermo,USA), 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Laborota 4001, Heidolph, Germany),氮吹儀(N-EVAPTM112, Organomation Associates, USA),超純水儀(Milli-Q Gradient, Millipore, France), 超聲波清洗器(KQ-600E, 江蘇, 昆山市超聲儀器有限公司), 高速離心機(jī)(TGL-10C, 上海, 安亭科學(xué)儀器廠), 微孔濾膜(0.22 μm, Millipore, France )。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣程序

試驗(yàn)用鯉, 試驗(yàn)進(jìn)行前抽取樣品檢測體內(nèi)不含分析物, 體重40—60 g, 富集試驗(yàn)前暫養(yǎng)在長方形玻璃水槽(70 cm×40 cm×50 cm) 3d, 每天換水1次, 期間不喂食。試驗(yàn)中挑選大小均勻、體重正常的鯉進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中連續(xù)充氧, 保持水中溶解氧大于5.0 mg/L, 鯉存活率大于95%。選擇經(jīng)過暫養(yǎng)的健康鯉, 隨機(jī)分為10個(gè)組, 每組約80尾。

準(zhǔn)確稱量一定量的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品, 用冷卻的淀粉乳濁液溶解定容至試驗(yàn)所需0.1、1.0和10.0 mg/kg bw 3個(gè)質(zhì)量濃度, 加入少量食用色素, 使乳濁液呈現(xiàn)紅色。在整個(gè)試驗(yàn)過程中, 記錄時(shí)間, 做好標(biāo)簽。具體操作方法如下: 在1 mL的注射器上接上約5 cm長度左右的塑料軟管,吸取己烯雌酚后, 將軟管通到魚的胃部, 灌藥后若鯉沒有紅色液體吐出, 即可作為試驗(yàn)用, 否則的話棄之不用。在整個(gè)試驗(yàn)過程中每天記錄水溫以及鯉的死亡情況。

血液樣品的采集: 將適合試驗(yàn)所用的鯉用抄網(wǎng)撈起,用干凈紗布擦干魚體后, 將1 mL注射器針頭插入鰓下心臟取血200—500 μL, 隨即放入離心管中(離心管事先要放入少量肝素鈉, 防止血凝固), 混合均勻后高速離心, 取上層血漿后, 置于–18℃條件下保存。肝胰臟和肌肉樣品的采集: 去除鯉的內(nèi)臟、皮和骨骼等, 取肌肉部分?jǐn)囁?并裝入密封袋保存; 將整個(gè)肝胰臟取出, 裝入離心管備用。肌肉和肝胰臟均須置于–18℃保存, 測定前先將其在室溫條件下解凍, 然后再進(jìn)行分析測定。

1.4 樣品前處理及凈化

樣品前處理及凈化方式參見文獻(xiàn)[19]。

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法

色譜柱: Thermo C18(1.9 μm, 2.1 mm i.d.×100 mm);流動(dòng)相: 甲醇和水; 流速: 0.25 mL/min; 進(jìn)樣量: 10 μL;柱溫: 35℃。

電離方式: HESI-; 離子傳輸管溫度: 350℃; 氣化溫度: 350℃; 鞘氣壓力: 40 arb; 輔助氣流量: 10 arb; 噴霧電壓: 3000 V。己烯雌酚監(jiān)測離子對(duì): 267>222, 267>251;雙烯雌酚監(jiān)測離子對(duì): 265>93, 265>249; D8-己烯雌酚監(jiān)測離子對(duì): 275>259。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)過程中對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析測定, 并且取平行組的平均值, 采用DAS 2.0計(jì)算程序, 處理不同濃度口灌給藥后鯉體內(nèi)的己烯雌酚和雙烯雌酚的含量-時(shí)間數(shù)據(jù),并且計(jì)算出有關(guān)代謝參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 己烯雌酚及雙烯雌酚的定量分析

配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100和200 ng/mL己烯雌酚及雙烯雌酚混標(biāo)溶液, 流動(dòng)相定容,內(nèi)標(biāo)法定量, 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.00618764x–0.0171144, 相關(guān)系數(shù)R2=0.9994; 雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.00732259x+0.0103639, 相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。在空白鯉樣品中添加己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液, 添加水平為0.5 μg/kg時(shí), 信噪比(S/N)大于10, 表明己烯雌酚檢測下限(LOD)可達(dá)0.5 μg/kg; 同理雙烯雌酚定量下限(LOQ)可達(dá)1.0 μg/kg。

2.2 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉血漿中的分布和消除

在鯉口灌給藥后, 血漿中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時(shí)間曲線如圖 1所示。自一次口灌給藥后, 鯉體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸增大, 均在 2h達(dá)到最大值, 隨后己烯雌酚含量逐漸減少, 分別在10、12和12h降至檢出限以下, 在消除階段均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì), 平均消除速率分別 1.65、12.64和150.2 μg/(L×h)。在給藥后 0.25h檢測出雙烯雌酚, 給藥后2h達(dá)到最大濃度, 最大濃度分別為5.52、26.5和321 μg/L,并在8、12和12h降至檢出限以下, 消除速率趨勢(shì)與己烯雌酚一致, 其平均消除速率分別0.92、2.65和32.1 μg/(L×h)。

2.3 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肌肉中的分布和消除

圖1 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉血漿中的濃度-時(shí)間圖Fig.1 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in plasma versus time

圖2 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肌肉中的濃度-時(shí)間圖Fig. 2 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in muscle versus time

在鯉口灌給藥后, 肌肉中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時(shí)間曲線如圖2所示。肌肉中己烯雌酚含量逐漸增大, 均在10h達(dá)到最大濃度, 最大濃度值分別為25.4、395.6和7186 μg/kg; 隨后鯉體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸減少,上述3濃度分別在144、168和192h降至檢出限以下, 均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì); 至試驗(yàn)24h, 己烯雌酚已降至9.52、 85.36和665 μg/kg, 僅為最高濃度的 37.5%、21.6%和 9.25%, 己烯雌酚平均消除速度分別 0.19、2.50和 39.5 μg/(kg×h)。數(shù)據(jù)表明在高濃度條件下, 己烯雌酚的平均消除速率明顯大于低濃度條件下的平均消除速率; 若減少相同百分比的濃度, 高濃度條件下所需的時(shí)間更短。雙烯雌酚與己烯雌酚變化趨勢(shì)相似, 分別在給藥后0.5、0.25和0.1h檢測出雙烯雌酚,給藥后10h達(dá)到最大濃度, 最大濃度值分別為5.02、30.2和280.6 μg/kg, 并在96、14和168h降至檢出限以下, 雙烯雌酚表現(xiàn)出與己烯雌酚一致的消除速率趨勢(shì), 其平均消除速度分別 0.058、0.23 和 1.77 μg/(kg·h)。

2.4 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肝胰臟中的分布和消除

在鯉口灌給藥后, 肝胰臟中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時(shí)間曲線如圖 3所示, 相比較己烯雌酚在血漿及肌肉中的分布和消除, 肝胰臟表現(xiàn)出明顯的富集能力。自一次口灌給藥后, 肝胰臟中己烯雌酚含量逐漸增大,上述 3濃度均在 8h達(dá)到最大值, 最大值分別為 157.9、1589和20000.8 μg/kg; 隨后鯉體內(nèi)己烯雌酚含量逐漸減少, 上述3濃度分別在144、192和216h降至檢出限以下,均出現(xiàn)前期消除速率快、后期消除速率相對(duì)減緩的趨勢(shì);至試驗(yàn)24h, 己烯雌酚已降至25.2、 157.9和529.1 μg/kg,僅為最高濃度的 16.0%、9.94%和 2.65%, 己烯雌酚平均消除速度分別為 1.16、8.64和 96.2 μg/(kg×h)。數(shù)據(jù)表明在鯉的肝胰臟中, 高濃度條件下己烯雌酚的消除速率明顯大于低濃度條件下的消除速率; 若減少相同百分比濃度, 高濃度條件下所需的時(shí)間更短。雙烯雌酚與己烯雌酚變化趨勢(shì)相似, 均在給藥后 0.25h檢測出雙烯雌酚, 給藥后 8h達(dá)到最大濃度, 最大濃度分別為 29.7、358.6和5122.8 μg/kg, 并在96、168和192h降至檢出限以下, 消除速率趨勢(shì)與己烯雌酚一致, 其平均消除速度分別0.34、2.24 和 27.8 μg/(kg·h)。

圖3 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肝胰臟中的濃度-時(shí)間圖Fig. 3 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in liver versus time

2.5 己烯雌酚在鯉血漿、肌肉和肝胰臟中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用 DAS2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序, 計(jì)算有關(guān)鯉藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù); 取其中一組己烯雌酚濃度-時(shí)間數(shù)據(jù), 用對(duì)數(shù)圖進(jìn)行初步判斷, 可見lgC與t呈雙指數(shù)函數(shù)特征, 初步判斷該藥在鯉體內(nèi)不是一室模型, 可能為二室模型或三室模型; 相比較三室模型, 二室模型與所測數(shù)據(jù)有更好的擬合度, 因此本研究采用二室模型。結(jié)果見表1。

t1/2β(己烯雌酚的消除相半衰期)在血漿和肝胰臟中,隨著口灌給藥濃度的增大, t1/2β逐漸增大。但在肌肉中出現(xiàn)相反的規(guī)律, 可能是當(dāng)肌肉體內(nèi)己烯雌酚含量越高時(shí),可以促進(jìn)某種酶的生長, 而在這種酶的作用下, 己烯雌酚消除速率增大, 因此其消除相半衰期越短, 此結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

表1 口灌給藥后己烯雌酚在鯉血漿、肌肉和肝胰臟中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab. 1 Pharmacokinetic parameters of Diethylstilbestrol in plasma, muscle and liver of Cyprinus carpio

AUC (己烯雌酚濃度-時(shí)間曲線下面積)以口灌給藥相當(dāng)于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟中AUC 由高到低依次為: 肝胰臟[22913.795 μg/(kg×h)] >肌肉[6027.142 μg/(kg×h)]>血漿[577.111 μg/(L×h)]; 血漿、肌肉和肝胰臟中 AUC值相差很遠(yuǎn), 肝胰臟對(duì)己烯雌酚的吸收量約是肌肉吸收量的4倍和血漿吸收量的40倍, 說明己烯雌酚的蓄積能力因組織的不同有較大差別。

CL/F與 t1/2β都是衡量己烯雌酚在鯉各組織消除快慢的指標(biāo)。以鯉血漿為例, 灌藥質(zhì)量濃度越大, CL/F值越小,以口灌給藥相當(dāng)于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟的 CL/F值依次為 1.591、0.166和 0.044 L/(h·kg), 在0.1 mg/kg bw和 10.0 mg/kg bw濃度組 CL/F值變化規(guī)律與1.0 mg/kg bw一致。

當(dāng)口灌給藥后, 當(dāng)達(dá)到 Cmax后, 其含量逐漸下降, 血漿中己烯雌酚濃度分別在8、10和10h下降了90%以上; 肌肉中己烯雌酚濃度分別在120、72和24h下降了90%以上;肝胰臟中己烯雌酚濃度分別在72、24和24h下降了90%以上; 如己烯雌酚在肝胰臟中消除 90%比肌肉中所用時(shí)間短, 但其濃度降至檢出限以下比肌肉所用時(shí)間長。

雙烯雌酚作為代謝物, 部分相關(guān)吸收參數(shù)無法使用軟件計(jì)算, 因此本研究僅借鑒使用了消除試驗(yàn)部分的參數(shù) t1/2β和 CL/F, 兩參數(shù)均可表明雙烯雌酚在鯉體內(nèi)消除速率的快慢。以口灌給藥相當(dāng)于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟中t1/2β值分別為2.517、4.028和254.498h, 血漿、肌肉和肝臟中CL/F值分別為6.105、0.962和0.201 L/(h·kg), 說明各組織消除一半己烯雌酚所用時(shí)間血漿最短、肌肉次之, 肝臟最長。

2.6 己烯雌酚休藥期的規(guī)定

目前水產(chǎn)品殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定己烯雌酚不得檢出。從試驗(yàn)結(jié)果看, 己烯雌酚在鯉的肝胰臟內(nèi)消除所需要的時(shí)間最長, 因此本研究將鯉的肝胰臟作為代謝靶組織。在鯉口灌給藥后, 鯉肝胰臟內(nèi)己烯雌酚和雙烯雌酚分別在6、8和9d后均降至檢出限以下, 因此基于本試驗(yàn)條件, 將己烯雌酚在鯉體內(nèi)的休藥期可定為6、8和9d。但在實(shí)際生產(chǎn)及養(yǎng)殖過程中, 一般多次重復(fù)給藥或者投喂含有己烯雌酚飼料, 并且會(huì)一直投喂直至停藥期滿、鯉起池為止。因此本試驗(yàn)得出的休藥期比實(shí)際生產(chǎn)、養(yǎng)殖情況要短, 綜合考慮各方面的影響因素可適當(dāng)延長己烯雌酚在鯉體內(nèi)的休藥期。同時(shí)影響鯉代謝的影響因素有很多, 研究表明水溫的影響最大。在一定的溫度范圍內(nèi), 隨著水溫升高,己烯雌酚在鯉體內(nèi)的代謝強(qiáng)度增強(qiáng); 水溫降低, 其代謝強(qiáng)度將會(huì)減弱。文獻(xiàn)報(bào)道: 每當(dāng)水溫升高 1℃, 藥物的代謝速度和消除速度一般情況下會(huì)提高 10%左右[20], 因此在實(shí)際養(yǎng)殖過程中, 應(yīng)根據(jù)外界環(huán)境和養(yǎng)殖習(xí)慣適當(dāng)縮短或延長藥物的休藥期。

3 結(jié)論

當(dāng)鯉口灌給藥后, 在相同條件下, 鯉的肝胰臟中藥物濃度最大, 其次是肌肉, 血漿最小; 并且肝胰臟的平均消除速率、濃度最高值以相對(duì)于灌藥濃度的倍數(shù)均高于血漿和肌肉; 即使肝胰臟具有最大的藥物平均消除速率,但若將藥物消除至檢出限以下, 肝胰臟所需時(shí)間仍最長。根據(jù)相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù), 初步探討了己烯雌酚在鯉體內(nèi)的休藥期。但試驗(yàn)條件和實(shí)際生產(chǎn)過程存在一定差別, 應(yīng)根據(jù)外界環(huán)境和養(yǎng)殖習(xí)慣適當(dāng)縮短或延長藥物的休藥期,而不應(yīng)該只單純規(guī)定一個(gè)休藥期, 最終達(dá)到保障消費(fèi)者食用安全的目的。