川芎嗪對UVA誘導人皮膚成纖維細胞衰老的拮抗作用及MMP-1、MMP-3 mRNA表達影響

趙敏玲 劉仲榮 陳胡林 朱英杰 嚴苗苗 范秀針

川芎嗪對UVA誘導人皮膚成纖維細胞衰老的拮抗作用及MMP-1、MMP-3 mRNA表達影響

趙敏玲 劉仲榮 陳胡林 朱英杰 嚴苗苗 范秀針

目的 探討川芎嗪對長波紫外線（UVA）誘導人皮膚成纖維細胞（HDF）衰老的拮抗作用及對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-3 mRNA表達的影響。方法 酶消化法分離HDF進行原代培養(yǎng)，用不同濃度川芎嗪分別作用UVA多次照射前后的HDF。CCK-8法檢測川芎嗪作用24、48、72 h或川芎嗪預處理24 h進行多次UVA照射的各組HDF體外增殖情況。光學顯微鏡下觀察經(jīng)多次UVA照射的各組細胞形態(tài)變化及β半乳糖苷酶染色情況，實時熒光定量PCR檢測各組細胞內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA相對表達量。結果 濃度為20、50 mg/L的川芎嗪作用HDF 24、48、72 h對細胞的體外增殖活性無促進或抑制作用，但100 mg/L作用48 h對HDF出現(xiàn)短暫抑制作用，與未給藥組比較細胞增殖活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。20、50、100 mg/L的川芎嗪預處理HDF 24、48、72 h對經(jīng)多次UVA照射的HDF體外增殖均有一定的促進作用，各組間細胞增殖活性在3個時間點差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為17.451，15.231，23.535，均P＜0.01）。多次UVA照射后HDF形態(tài)出現(xiàn)體積變大、顆粒增加及β半乳糖苷酶表達增加等衰老現(xiàn)象，接近復制性衰老的HDF（P55組）。而20、50、100 mg/L的川芎嗪預處理HDF 24 h可減輕這種衰老現(xiàn)象，其中UVA組β半乳糖苷酶陽性率（68.417± 1.181）%，UVA＋川芎嗪20 mg/L組（58.167±5.620）%，UVA＋川芎嗪50 mg/L組（45.167±5.502）%，UVA＋川芎嗪100 mg/L組（43.000±2.000）%，未照射組（33.667±5.865）%，P55組（76.000±6.557）%，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=45.918，P＜0.01），且UVA＋各濃度川芎嗪組、未照射組與UVA組比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。川芎嗪可降低多次UVA照射誘導的HDF表達MMP-1和MMP-3 mRNA，且UVA＋各濃度川芎嗪組、未照射組與UVA組比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結論 川芎嗪對多次UVA照射誘導的HDF衰老有拮抗作用，并能降低HDF衰老過程中MMP-1和MMP-3 mRNA的表達。

川芎嗪；成纖維細胞；細胞衰老；基質(zhì)金屬蛋白酶1；基質(zhì)金屬蛋白酶3；紫外線；細胞增殖

人皮膚成纖維細胞（HDF）能維持皮膚的彈性及水分，皮膚老化出現(xiàn)松弛、干燥粗糙、彈性下降、皺紋增多等現(xiàn)象都與HDF的數(shù)量減少及分泌合成功能下降有關［1-2］。長波紫外線（UVA）穿透力強，引起成纖維細胞損傷，長期反復照射，引起衰老相關標志物β半乳糖苷酶表達增加，還誘導HDF表達基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）增加。MMP是降解皮膚膠原纖維的主要因子，可促進皮膚光老化現(xiàn)象的發(fā)生［3］。鹽酸川芎嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine）是川芎中的主要活性生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪有抗氧化應激［4］、抗腫瘤［5］等作用。我們研究川芎嗪對多次UVA照射誘導HDF衰老以及MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響，為其抗皮膚光老化提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、主要儀器和試劑

鹽酸川芎嗪（白色干粉劑，上海純優(yōu)生物科技有限公司，貨號P1010，CAS：76494-51-4，純度≥98%）CCK-8試劑盒、β半乳糖苷酶染色試劑盒（美國Sigma公司），Transcriptor First Strand cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green I Master（ROX）（美國Roche公司）。UVA臺式紫外線治療儀（SS-04A）、UVA輻射探測儀（上海希格瑪高技術有限公司），酶標儀（美國Life Technologies公司），PCR儀（美國Bio-Rad公司），Rotor-Gene 6000 PCR儀（美國Corbett公司）。

二、方法

1.藥物配制：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液常溫下溶解鹽酸川芎嗪，分別配制成濃度為20、50、100 mg/L。

2.細胞培養(yǎng)：HDF為原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，取自門診手術室健康青年男性（年齡18～23歲）包皮環(huán)切術后進行標本分離的包皮組織，采用酶消化法分離留取HDF進行原代培養(yǎng)，連續(xù)傳代，取第3～10代細胞進行實驗。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

3.細胞分組和UVA照射：部分HDF分成未給藥組（只給予含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液）、20 mg/L川芎嗪組、50 mg/L川芎嗪組、100 mg/L川芎嗪組，觀察川芎嗪預處理24、48、72 h對成纖維細胞增殖活性的影響。另一部分HDF分成5組：UVA＋20 mg/L川芎嗪組、UVA＋50 mg/L川芎嗪組、UVA＋100 mg/L川芎嗪組、UVA組（高糖DMEM培養(yǎng)液＋UVA照射）、未照射組（不照射，其余處置與UVA組同），各藥物組先用川芎嗪預處理HDF細胞24 h后進行UVA照射，以觀察川芎嗪對多次UVA照射誘導HDF衰老以及MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響。

UVA照射：HDF接種于直徑30 mm的培養(yǎng)皿中，接種密度為1×104/皿，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合時進行UVA照射，利用UVA輻射探測儀檢測UVA的強度（照射強度10 mW/cm2，照射距離10 cm）調(diào)整照射時間使照射劑量為10 J，每日1次，連續(xù)照射5次，累積劑量為50 J。每次UVA照射前吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，再以PBS覆蓋細胞，置于冰上照射。

4.CCK-8法檢測川芎嗪對UVA照射前后HDF增殖活性的影響：取各組HDF，調(diào)整濃度為3.0× 103/ml接種于96孔板，每孔100 μl，每組設3個復孔，培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2h，酶標儀測定在450 nm波長處每孔的吸光度值。實驗重復3次，取均值。

5.光鏡下觀察HDF形態(tài)變化及β半乳糖苷酶染色：取各組細胞，多次UVA照射后24 h，光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，以衰老（傳至55代，P55）HDF作為衰老陽性對照組。β半乳糖苷酶染色于光學倒置顯微鏡下觀察細胞著色情況并拍照，藍色細胞為陽性，每孔隨機挑選4個視野（×100）計數(shù)至少500個細胞，計算染色陽性率［6］，每個視野染色陽性細胞百分比=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。實驗重復3次。

6.實時熒光定量PCR檢測HDF MMP-1、3的mRNA表達：取各組細胞，多次UVA照射后24 h提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。PCR擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個循環(huán)。每次反應設3個復孔。反應結束后，采用△△Ct法分析目的基因相對表達量。目的基因引物：MMP-1上游：5′-CCCAAGGACATCTACAGC-3′，下游：5′-CTCTGGGATCAACGTCAG-3′，擴增片段長度為630 bp；MMP-3上游：5′-TATGGATCCCC CCCTGACTCCCCTGAG-3′，下游：5′-ATGGAATTCA GGTTCAAGCTTCCTGAGG-3′，擴增片段長度為434 bp。β肌動蛋白引物：上游5′-GTCCTCTCCCAA GTCCACAC-3′，下游：5′-GGGA-GACCAAAAGCCT TCAT-3′，擴增片段205 bp。

結果

1.川芎嗪對HDF體外增殖活性的影響：見表1。與未加藥組比較，川芎嗪100 mg/L作用48 h組細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05），而作用24 h和72 h組沒有統(tǒng)計學變化（均P＞0.05）。其余各濃度組的細胞增殖活性與未加藥組比較在各時間點差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。據(jù)此在后續(xù)非細胞增殖實驗中選擇24 h作為處理時間。

表1 不同濃度川芎嗪作用不同時間對未照射人皮膚成纖維細胞體外增殖的影響（A450，±s）

表1 不同濃度川芎嗪作用不同時間對未照射人皮膚成纖維細胞體外增殖的影響（A450，±s）

注：n=3。a：與未加藥組比較，P＜0.05

分組 作用時間24 h 48 h 72 h未加藥組 0.343±0.035 0.616±0.077 0.890±0.046川芎嗪20 mg/L組 0.376±0.014 0.574±0.035 0.793±0.088川芎嗪50 mg/L組 0.365±0.029 0.627±0.034 0.809±0.069川芎嗪100 mg/L組 0.360±0.037 0.486±0.035a 0.860±0.049 F值 0.815 5.216 1.375 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＞0.05

2.川芎嗪對多次UVA照射后HDF體外增殖活性的影響：見表2。與未照射組比較，經(jīng)UVA多次照射后各組細胞增殖活性明顯降低，除48h時，UVA＋川芎嗪100mg/L組外，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與UVA組比較，川芎嗪各濃度組細胞增殖活性升高，且UVA＋川芎嗪100 mg/L組在24、48、72 h時與UVA組差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結果顯示，多次UVA照射對HDF的增殖活性有抑制作用，而川芎嗪在濃度100 mg/L范圍內(nèi)能減輕這種抑制作用，且在濃度100 mg/L時作用更顯著，在48 h時細胞增殖活性與未照射組差異無統(tǒng)計學意義。

表2 川芎嗪對多次長波紫外線（UVA）照射后HDF體外增殖活性的影響（A450，±s）

表2 川芎嗪對多次長波紫外線（UVA）照射后HDF體外增殖活性的影響（A450，±s）

注：n=5。a：與未照射組比較，P＜0.05；b：與UVA組比較，P＜0.05。HDF：人皮膚成纖維細胞

作用時間24 h 48 h 72 h 0.522±0.037a 0.738±0.037a0.804±0.023a UVA＋川芎嗪20 mg/L組 0.566±0.046a 0.779±0.041a0.925±0.040ab UVA＋川芎嗪50 mg/L組 0.606±0.016ab 0.763±0.055a0.932±0.053ab UVA＋川芎嗪100 mg/L組 0.621±0.032ab 0.914±0.065b0.984±0.072ab未照射組 0.711±0.049b 0.894±0.020b 1.081±0.024b F值 17.451 15.231 23.535 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3.川芎嗪對多次UVA照射后HDF形態(tài)變化的影響：見圖1。未照射組細胞生長活躍，主要表現(xiàn)為細長梭形、相互平行排列或呈放射狀和漩渦狀排列。P55組細胞有明顯老化現(xiàn)象，細胞體積變大、形狀扁平，或有過度伸展，伸展末端細長有分枝，胞內(nèi)顆粒增加。UVA組細胞與P55組細胞有類似的變化，但程度較輕。而川芎嗪各濃度組細胞類似的變化則明顯減輕，且在100 mg/L時接近未照射組細胞形態(tài)。

4.HDFβ半乳糖苷酶染色情況：多次UVA照射后HDF β半乳糖苷酶染色陽性率明顯增加，其中UVA組β半乳糖苷酶陽性率為（68.417±1.181）%，UVA＋川芎嗪20mg/L組為（58.167±5.620）%，UVA＋川芎嗪50mg/L組為（45.167±5.502）%，UVA＋川芎嗪100mg/L組為（43.000±2.000）%，未照射組為（33.667± 5.865）%，P55組為（76.000±6.557）%，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=45.918，P＜0.01），且UVA組、UVA＋川芎嗪20 mg/L組、UVA＋川芎嗪50 mg/L組、UVA＋川芎嗪100mg/L組與未照射組比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），UVA組細胞陽性率接近P55組，且兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。川芎嗪能降低多次UVA照射引起的β半乳糖苷酶著色增加，其作用有隨濃度的增加而增大的趨勢，UVA＋川芎嗪20 mg/L組、UVA＋川芎嗪50mg/L組、UVA＋川芎嗪100 mg/L組與UVA組的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖1 顯微鏡觀察川芎嗪對多次長波紫外線（UVA）照射后HDF形態(tài)變化的影響（×200） 未照射組（1A）細胞形態(tài)呈細長梭形；UVA＋川芎嗪100 mg/L組（1B）與未照射組細胞形態(tài)較接近，但細胞體積較未照射組有所增大；UVA組（1C）細胞生長較稀疏，體積變大、形狀扁平、胞內(nèi)顆粒增加；P55組（1D）與UVA組細胞形態(tài)接近，細胞生長稀疏，體積變大、形狀扁平、伸展末端細長有分支、胞內(nèi)顆粒增加

表3 川芎嗪對多次長波紫外線（UVA）照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達（2－△△C）t的影響（±s）

表3 川芎嗪對多次長波紫外線（UVA）照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達（2－△△C）t的影響（±s）

注：n=3。a：與未照射組比較，P＜0.05；b：與UVA組比較，P＜0.05。HDF：人皮膚成纖維細胞；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

分組 MMP-1 MMP-3 UVA組 7.430±1.544a 3.507±0.611a UVA＋川芎嗪20 mg/L組 3.123±1.040ab 2.130±0.191ab UVA＋川芎嗪50 mg/L組 1.503±0.388b 1.870±0.108ab UVA＋川芎嗪100 mg/L組 1.653±0.270b 1.190±0.030ab未照射組 1.000±0.000b 1.000±0.000b F值 29.151 267.029 P值 ＜0.01 ＜0.01

5.川芎嗪對多次UVA照射后HDF MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響：見表3。與UVA組比較，不同濃度川芎嗪能降低衰老HDF中MMP-1、MMP-3 mRNA表達，且差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與未照射組比較，UVA組與川芎嗪20 mg/L組MMP-1、MMP-3 mRNA表達量均顯著增加（均P＜0.05）。川芎嗪 50、100 mg/L濃度組 MMP-1的mRNA表達量與未照射組比較無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），而MMP-3 mRNA表達量差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

討論

川芎嗪是從中藥川芎中提取出來的活性生物單體，具有廣泛的藥理作用。本研究用川芎嗪作為研究對象，以多次低劑量UVA照射HDF誘導細胞衰老，探討川芎嗪對UVA誘導HDF衰老的保護作用。結果顯示，100 mg/L川芎嗪處理細胞48 h后出現(xiàn)短暫的細胞增殖抑制作用，可能與川芎嗪抑制成纖維細胞DNA合成有關［7］，但至72 h時抑制作用消失，提示其可能為一過性，細胞自身可對抗這種抑制作用。進一步研究顯示，多次UVA照射可誘導HDF生長緩慢，而川芎嗪在一定濃度范圍內(nèi)可減緩這種衰老現(xiàn)象，且在濃度為100 mg/L作用48 h后這種保護作用更強，該組細胞增殖活性與未照射組差異無統(tǒng)計學意義，但與UVA照射前100 mg/L川芎嗪作用HDF 48 h出現(xiàn)一過性抑制作用相矛盾，我們推測這種矛盾可能與低濃度川芎嗪誘導HDF出現(xiàn)適應性反應有關。低劑量電離輻射可誘導生物體或細胞出現(xiàn)適應性反應已有較深入的研究并得到了證實［8］。普遍認為適應性反應的機制與細胞內(nèi)Ca2＋、蛋白激酶C（PKC）激活進一步誘導保護性蛋白有關［9］。

衰老成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞均表達β半乳糖苷酶，而休眠細胞和終末分化細胞則缺乏。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能降低多次UVA照射引起HDF的β半乳糖苷酶表達，并改善細胞體積變大、顆粒增加等細胞衰老現(xiàn)象，提示川芎嗪能延緩多次UVA照射誘導的HDF衰老。

本課題組前期［10-11］研究表明，多次低劑量UVA能誘導HDF分泌MMP增加，降解細胞外基質(zhì)，從而促進皮膚光老化皺紋形成。有學者認為，MMP-1和MMP-3在衰老的皮膚中表達增加，促進皮膚光老化的發(fā)生［12］。研究表明，UVA的多次照射通過誘導細胞內(nèi)氧自由基累積等作用，促進成纖維細胞衰老的發(fā)生，改變其生物學特性，增加MMP分泌，使膠原纖維及彈性纖維數(shù)量減少、結構崩解，從而引起皮膚干燥、深皺紋、粗糙、皮革樣外觀、色素沉著等皮膚光老化的改變［13］。本研究中，與UVA組比較，不同濃度川芎嗪均能降低多次UVA照射誘導的HDF內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA表達。據(jù)此推測，川芎嗪有一定的抗皮膚光老化作用，可以通過降低HDF內(nèi)MMP-1和MMP-3 mRNA表達保護彈性纖維免遭水解，對抗皮膚老化。

綜上所述，我們的實驗結果初步證實川芎嗪能延緩多次UVA照射引起的HDF生長緩慢、細胞顆粒增加、體積變大以及β半乳糖苷酶表達增加等衰老現(xiàn)象，可能與川芎嗪清除氧自由基［4］甚至潛在地誘導細胞適應性反應有關，其機制尚待進一步探討。

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Inhibitory effect of tetramethylpyrazine on ultraviolet A-induced senescence and matrix metalloproteinase-1 and-3 mRNA expressions in human dermal fibroblasts

Zhao Minling,Liu Zhongrong,Chen Hulin,Zhu Yingjie, Yan Miaomiao,Fan Xiuzhen.Department of Dermatology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou 510010,China
Corresponding author:Liu Zhongrong,Email:pfklzr@163.com

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of tetramethylpyrazine（TMP）on ultraviolet A-induced senescence as well as matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and-3（MMP-3）mRNA expressions in human dermal fibroblasts（HDFs）.MethodsHDFs were isolated from the prepuce by enzymatic digestion,and subjected to primary culture.Cultured HDFs were randomly divided into several groups:control group cultured in high-glucose DMEM medium and receiving no treatment,three TMP groups treated with 20,50 and 100 mg/L TMP respectively,UVA group receiving UVA radiation alone,UVA＋TMP groups pretreated with 20,50 and 100 mg/L TMP respectively for different durations followed by UVA radiation.UVA radiation was given once daily for 5 consecutive days.The 55th passage HDFs served as the P55 group（senescence control group）.Subsequently,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferative activity of HDFsin vitro,optical microscopy to observe the morphologic changes of HDFs after UVA radiation,β-galactosidase staining to estimate the senescence in HDFs,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3 in HDFs.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance（ANOVA）followed by least significant difference（LSD）-ttest or Dunnett′s T3 test.ResultsCompared with the control group,the proliferation of HDFs was significantly but transiently inhibitedin vitroafter the treatment with 100 mg/L TMP for 48 hours（P＜0.05）,but showed no significant changes after the treatment with 20 or 50 mg/L TMP for 24,48 or 72 hours or after the treatment with 100 mg/L TMP for 24 or 72 hours（allP＜0.05）.The pretreatments with TMP of 20,50 and 100 mg/L for 24,48 and 72 hours all promoted the proliferation of HDFs to acertain degree in the UVA＋TMP groups compared with the UVA group,with significant differences in cellular proliferative activity among the UVA group,UVA＋TMP groups and control group at 24,48 and 72 hours（F=17.451, 15.231,23.535,allP＜0.01）.Compared with the UVA group,the proliferative activity of HDFs was significantly increased in UVA＋100-mg/L TMP group at 24,48,72 hours,UVA＋50-mg/L TMP group at 24 and 72 hours and UVA＋20-mg/L TMP group at 72 hours.After repetitive UVA radiation,HDFs in the UVA group experienced an increase in cell volume,granule acount,and β-galactosidase expression,which was similar to the changes in the P55 group,while the pretreatments with 20,50 and 100 mg/L TMP for 24 hours suppressed these UVA-induced changes in HDFs.The percentage of β-galactosidase-positive HDFs was 68.417%±1.181%in the UVA group,58.167% ±5.620%in the UVA＋20-mg/L TMP group,45.167%±5.502%in the UVA＋50-mg/L TMP group,43.000%±2.000%in the UVA＋100-mg/L TMP group,33.667% ±5.865%in the control group,and 76.000% ±6.557%in the P55 group,with significant differences among these groups（F=45.918,P＜0.01）.Furthermore,the UVA group significantly differed from the UVA＋TMP groups and control group in the percentage of β-galactosidase-positive HDFs and mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3（allP＜0.05）.Conclusion TMP can protect HDFs against senescence induced by repetitive UVA radiation,and down-regulate the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-3 during senescence.

Tetramethylpyrazine;Fibroblasts;Cell aging;Matrix metalloproteinase 1;Matrix metalloproteinase 3;Ultraviolet rays;Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.009

國家自然科學基金（30972652）；廣東省省級科技計劃項目（2013B021800053）

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科

劉仲榮，Email：pfklzr@163.com

2014-11-21）

（本文編輯：尚淑賢）