醋酸甲羥孕酮和復方庚酸炔諾酮對BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響

韓燕 鄭冰潔 尹躍平 鐘銘英 于瑞星

醋酸甲羥孕酮和復方庚酸炔諾酮對BALB/c小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響

韓燕 鄭冰潔 尹躍平 鐘銘英 于瑞星

目的 比較醋酸甲羥孕酮和復方庚酸炔諾酮對小鼠下生殖道感染沙眼衣原體敏感性的影響。方法 60只雌性BALB/c小鼠隨機分為6組，分別為空白對照組、醋酸甲羥孕酮對照組、復方庚酸炔諾酮對照組、無性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮感染組、復方庚酸炔諾酮感染組。其中，空白對照組、醋酸甲羥孕酮對照組和復方庚酸炔諾酮對照組小鼠在接受相應的激素單次處理后第5天通過陰道接種MyCoy細胞懸液；無性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮處理感染組和復方庚酸炔諾酮處理感染組小鼠在接受相應的激素單次處理后第5天通過陰道感染接種含1×107E型沙眼衣原體包涵體形成單位（ifu）的懸液。接種后第4、7、14天，采集小鼠的陰道沖洗液進行細胞培養(yǎng)，并在每個時間點每組隨機選取3只小鼠處死，取陰道、子宮標本固定，HE染色鏡檢。采用χ2檢驗比較不同組別的感染率。結果 接種后對照組均無沙眼衣原體生長，無性激素處理感染組和復方庚酸炔諾酮感染組在接種沙眼衣原體后第4天培養(yǎng)陽性率均為1/10，第7天和14天均無沙眼衣原體生長；醋酸甲羥孕酮感染組在接種后第4天培養(yǎng)陽性率為7/10，第7天為2/7，第14天無沙眼衣原體生長。Fisher精確概率計算顯示，醋酸甲羥孕酮感染組接種后，第4天感染率高于無性激素處理組和復方庚酸炔諾酮感染組（P=0.03）；而第7天醋酸甲羥孕酮感染組感染率與其他兩個組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.23）。醋酸甲羥孕酮處理的兩組在接種后第4天、第7天和第14天陰道內(nèi)黏液增多，陰道復層鱗狀上皮變薄，上皮細胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤，接種沙眼衣原體后第4天陰道發(fā)生病理變化，即管腔出現(xiàn)大量炎性分泌物，組織輕度水腫，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤。復方庚酸炔諾酮處理的兩組在各時間點陰道表現(xiàn)均正常，而子宮在接種后7 d，出現(xiàn)組織輕度水腫，腺腔擴張，分泌物潴留，散在炎細胞浸潤。結論 小鼠經(jīng)醋酸甲羥孕酮處理后動情周期固定在動情間期，陰道上皮黏液化，可能有助于增加小鼠沙眼衣原體在陰道內(nèi)感染的敏感性。經(jīng)復方庚酸炔諾酮處理后小鼠動情期沒有明顯改變，子宮有改變，而這不能改變沙眼衣原體在陰道內(nèi)感染的敏感性。

醋酸甲羥孕酮；炔諾酮；沙眼衣原體；疾病模型，動物；小鼠；生殖道感染

沙眼衣原體感染生殖道上皮細胞后，可以誘導組織損傷，如果患者得不到及時的診斷和治療會導致持續(xù)的傳播并引起嚴重的并發(fā)癥和后遺癥。構建動物感染模型是了解沙眼衣原體感染致病機制、免疫、病理、進展過程以及觀察藥物療效和毒性等的重要手段。沙眼衣原體在靈長類、豚鼠、豬、小鼠等動物的生殖器官均能引起感染。小鼠是常用的動物模型，但研究顯示小鼠生殖道感染后的表現(xiàn)與人生殖道感染后的表現(xiàn)不同，很少引起系統(tǒng)性病變，炎癥較輕，且很快會被清除。孕激素處理能夠增加小鼠陰道對沙眼衣原體的易感性，模擬人感染的自然進程。為了解不同孕激素對小鼠感染沙眼衣原體敏感性的影響，我們選取復方庚酸炔諾酮和醋酸甲羥孕酮兩種激素，觀察并比較這兩種激素處理后小鼠下生殖道感染沙眼衣原體的情況。

材料與方法

一、材料

6周齡雌性SPF級BALB/c小鼠產(chǎn)自揚州大學動物中心［SCXK（蘇）2012-0004］，體重（21.47±1.30）g，于中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所實驗動物中心按要求喂養(yǎng)。小鼠籠具為獨立送風隔離籠具，換氣次數(shù)為每小時30次，進風風速為30 m/h；溫度為（22±2）℃，相對濕度為（30±5）%。飼料為經(jīng)60Co輻照滅菌后的SPF級小鼠維持糧，產(chǎn)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司［蘇飼審（2008-01.0080）］，每日每籠投喂約50 g。飲用水為滅菌水，每日每籠約200 ml。E型沙眼衣原體Bour標準株來自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection,ATCC），本實驗室保存?zhèn)鞔?。醋酸甲羥孕酮注射液（150 mg/ml，批號X06089）產(chǎn)自美國輝瑞制藥有限公司。復方庚酸炔諾酮注射液（每ml含庚酸炔諾酮 50 mg，戊酸雌二醇 5 mg，批號：110401）產(chǎn)自浙江仙琚制藥有限公司。

二、方法

1.E型沙眼衣原體株體外培養(yǎng)、制備感染液：用E型沙眼衣原體株感染MyCoy細胞，在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，收集單層感染McCoy細胞，經(jīng)傳代使McCoy細胞被感染率達到90%，收集細胞保存在蔗糖谷氨酸磷酸鹽緩沖液中，定量后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.小鼠喂養(yǎng)及接種：60只6周齡的雌性BALB/c小鼠［1］稱重后隨機分為6組，分別為空白對照組、醋酸甲羥孕酮對照組、復方庚酸炔諾酮對照組、無性激素處理感染組、醋酸甲羥孕酮感染組、復方庚酸炔諾酮感染組。實驗前使用細胞培養(yǎng)的方法對每只小鼠的陰道沖洗液進行沙眼衣原體檢測，確證每只小鼠實驗前不攜帶沙眼衣原體。各組小鼠在標準條件下適應環(huán)境喂養(yǎng)1周后，在醋酸甲羥孕酮對照組及感染組，單側大腿外側肌內(nèi)注射醋酸甲羥孕酮注射液（150 g/L）20 μl［2-3］；在復方庚酸炔諾酮對照組及感染組，單側大腿外側肌內(nèi)注射復方庚酸炔諾酮注射液20 μl。激素單次處理5 d后使用移液器吸取20 μl濃度約為 1 × 108包涵體形成單位（ifu）/ml的E型沙眼衣原體株接種至相應各組小鼠的陰道內(nèi)（深入陰道0.5 cm），接種后仰臥靜止1 min。對照組接種MyCoy細胞懸液。

3.小鼠大體情況觀察：接種后第4、7、14天測量小鼠體重并記錄，同時觀察小鼠活動情況、外生殖道表現(xiàn)及外陰分泌物情況等并拍照記錄。

4.細胞培養(yǎng)及病理檢測小鼠生殖道沙眼衣原體：接種后第4、7、14天，用 RPMI1640 運送液 100μl，每次吸取20 μl深入小鼠陰道0.5 cm處，停留30 s后回收沖洗液，反復3次，得到約100 μl陰道沖洗液。采集得到的陰道沖洗液標本50 μl用于細胞培養(yǎng)檢測，50 μl用于盲傳，每次檢測均設衣原體陽性對照和陰性對照。每一玻片見到≥1個包涵體為陽性［4］；第1次檢測陰性的標本將利用盲傳保存液再檢測和盲傳，共3次。3次盲傳后檢測仍為陰性的標本則認定為真正的陰性標本。組織形態(tài)學觀察：接種后第4、7、14天，各組隨機取3只小鼠，收集陰道沖洗液后頸椎脫臼處死，解剖取陰道、子宮標本，4%甲醛液固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色鏡檢。

5.統(tǒng)計學方法：使用EXCEL2013錄入數(shù)據(jù)，用IBM SPSS Statistics 20進行數(shù)據(jù)整理、轉換和分析。采用χ2檢驗比較不同組別的感染率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、沙眼衣原體培養(yǎng)的結果

在各個時間點采集的陰道沖洗液標本中，空白對照組、醋酸甲羥孕酮對照組、復方庚酸炔諾酮對照組培養(yǎng)的結果均為陰性。Fisher精確概率計算顯示醋酸甲羥孕酮處理組4 d后的感染率（7/10，95%CI：35.4%～91.9%）高于無性激素處理組和復方庚酸炔諾酮處理組（均為1/10，95%CI0.5%～45.9%，P=0.03）；而7 d后感染率醋酸甲羥孕酮處理組（2/7，95%CI5.6%～69.7%）與其他兩個組（均為 0，95%CI0～43.9%），差異無統(tǒng)計學意義（P=0.23。14 d后所有組別均未感染沙眼衣原體。

二、小鼠接種沙眼衣原體后器官大體形態(tài)及組織病理表現(xiàn)

大體形態(tài)：空白對照組及無性激素處理感染組各時間點外陰、陰道內(nèi)黏液、解剖后子宮陰道均無異常。醋酸甲羥孕酮對照組及感染組在各時間點外陰、解剖后對照組陰道均無異常，但陰道內(nèi)黏液很多。復方庚酸炔諾酮對照組及感染組在各時間點外陰、陰道內(nèi)黏液、子宮陰道均無異常。組織病理表現(xiàn)：小鼠接種沙眼衣原體后第4天，第7天和第14天后醋酸甲羥孕酮對照組陰道均出現(xiàn)復層鱗狀上皮變薄、上皮細胞黏液化、管腔有分泌物、黏膜下層少量炎癥細胞浸潤的表現(xiàn)，子宮腺腔正常，內(nèi)膜輕度水腫，散在少量炎癥細胞浸潤；醋酸甲羥孕酮感染組第4天陰道出現(xiàn)復層鱗狀上皮變薄，上皮細胞黏液化，管腔有大量炎性分泌物，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤，子宮內(nèi)膜水腫，炎癥細胞浸潤（圖1），而至第7天和第14天小鼠陰道病理改變和醋酸甲羥孕酮對照組基本相同。復方庚酸炔諾酮感染組和對照組在接種后的第4天，第7天和第14天的陰道表現(xiàn)均正常，而在沙眼衣原體感染后第7天（即注射激素后第12天）子宮組織輕度水腫，腺腔擴張，分泌物潴留，散在炎癥細胞浸潤（圖2）。

圖1 醋酸甲羥孕酮感染組小鼠接種沙眼衣原體后第4天組織學表現(xiàn)（HE×200） 1A：陰道：復層鱗狀上皮變薄，上皮細胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤；1B：子宮：腺腔正常，內(nèi)膜輕度水腫，散在少量炎癥細胞浸潤

圖2 復方庚酸炔諾酮感染組小鼠接種沙眼衣原體后第7天組織學表現(xiàn)（HE×200） 2A：子宮腺腔擴張，分泌物潴留，黏膜下層伴有少量的炎癥細胞浸潤；2B：子宮組織輕度水腫，腺腔擴張，分泌物潴留，散在炎癥細胞浸潤

討 論

雌性小鼠性成熟后，生殖器官發(fā)生增生、退化的周期性變化為動情周期。一般分為四期：動情前期、動情期、動情后期和動情間期。動情前期陰道復層鱗狀上皮細胞增厚但角化未完全；動情期陰道復層鱗狀上皮細胞厚且角化完全，表面的上皮細胞脫落至管腔中；動情后期表現(xiàn)為復層鱗狀上皮細胞退化，角化完全的細胞脫落，同時間質內(nèi)出現(xiàn)白細胞并浸潤表皮；動情間期陰道的上皮細胞變薄且黏液化，間質內(nèi)出現(xiàn)很多白細胞并通過表皮移入直至管腔。鼠的一個動情周期為4～5 d，可通過陰道脫落細胞的變化了解動情周期的全部過程［5］。實驗中各對照組及復方庚酸炔諾酮感染組在不同時間點可以觀察到不完全相同的動情周期的病理改變；而醋酸甲羥孕酮感染組小鼠動情周期一直維持在動情間期：復層鱗狀上皮變薄，上皮細胞黏液化，管腔有分泌物，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤。Tuffrey等［6］在1981年即發(fā)現(xiàn)孕激素是建立小鼠生殖道感染沙眼衣原體模型的關鍵因素。后續(xù)的動物研究已發(fā)現(xiàn)，孕酮預處理后可以增加小鼠對沙眼衣原體感染的易感性［7-8］，推測是在孕激素的影響下，小鼠生殖道上皮細胞層變薄并能夠穩(wěn)定地處在動情間期的環(huán)境下，允許建立感染。而我們觀察到醋酸甲羥孕酮感染組小鼠陰道上皮的改變證實了該假說。由于本實驗中每次采集的陰道沖洗液量不足以進行細胞因子的分析，故此假說尚待進一步驗證。而人群研究的結果同樣也顯示醋酸甲羥孕酮能夠增加人感染沙眼衣原體的風險［9］。

醋酸甲羥孕酮感染組接種沙眼衣原體后第4天小鼠陰道腔出現(xiàn)大量的炎癥分泌物，組織輕度水腫疏松，黏膜下層少量炎癥細胞浸潤，而陰道沖洗液的細胞培養(yǎng)結果基本為陽性，但在接種后第7天小鼠陰道炎性分泌物明顯減少，而陰道沖洗液的細胞培養(yǎng)結果基本為陰性，沖洗液細胞培養(yǎng)結果與病理切片觀察結果之間具有較好的相關性，均提示沙眼衣原體感染為急性感染［10］，主要表現(xiàn)為陰道炎，而子宮和子宮頸沒有嚴重的炎癥改變，且在解剖時未發(fā)現(xiàn)卵巢有所改變，因此未對小鼠的卵巢進行進一步作病理分析。未經(jīng)處理小鼠的動情后期及動情間期也會有炎癥細胞浸潤，因此研究者在進行沙眼衣原體動物模型建立時需要考慮到動情周期對病理表現(xiàn)的影響。我們觀察各時間點各小鼠的大體改變時未發(fā)現(xiàn)以往研究中所出現(xiàn)的特殊表現(xiàn)如，小鼠外陰紅腫，毛發(fā)脫落、灰暗無光澤等［3，11］，可能尚須進一步的實驗證實。

復方庚酸炔諾酮作為健康育齡婦女的避孕藥［12］，主要含有庚酸炔諾酮和戊酸雌二醇［13］，為雌激素及孕激素類避孕藥，系通過抑制垂體促性腺激素分泌而抑制排卵，達到避孕作用。本研究所用的復方庚酸炔諾酮含庚酸炔諾酮50 mg、戊酸雌二醇5 mg，避孕有效率達 99．8%［14］。雖然其中的炔諾酮是孕激素，但是由于雌激素的存在，小鼠的動情周期沒有出現(xiàn)孕激素影響的主要病理表現(xiàn)，復方激素對小鼠感染沙眼衣原體的敏感性沒有改變。這也從另一個側面驗證了小鼠動情間期生殖道上皮改變對增加小鼠對沙眼衣原體感染敏感性的重要性。

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Effects of medroxyprogesterone acetate and compound norethisterone enanthate on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection with

Chlamydia trachomatisHan Yan,Zheng Bingjie,Yin Yueping,Zhong Mingying,Yu Ruixing.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;National Center for Sexually Transmitted Disease Control,China Center for Disease Control and Prevention,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo compare the effects of medroxyprogesterone acetate （MPA）and compound norethisterone enanthate （CNE）on the susceptibility of BABL/c mice to lower reproductive tract infection withchlamydia trachomatis（Ct）.MethodsA total of 60 BALB/c mice were randomly and equally divided into 6 groups:MPA-pretreated control group and CNE-pretreated control group inoculated with MyCoy cell suspensions in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,blank control group receiving no treatment,MPA-pretreated infected group and CNE-pretreated infected group inoculated with 1 × 107inclusion-forming units（IFU）of Ct serovar E in the vagina on the 5th day after single treatment with MPA and CNE respectively,control infected group inoculated with the same quantity of IFU of Ct serovar E in the vagina but receiving no pretreatment.On day 4,7 and 14 after inoculation,vaginal irrigation fluid was obtained from all the mice for cell culture of Ct.Three mice were randomly selected from each of these groups at the above three time points and sacrificed,and vaginal and uterine tissue specimens were obtained for hematoxylin-eosin（HE）staining and microscopic examination.Chi-square test and Fisher's exact test were conducted to compare infection rate among different groups.ResultsNo growth of Ct was observed in the three control groups at the above time points.The culture-positive rate of Ct was 1/10 on day 4 but 0 on day 7 and 14 in boththe CNE-pretreated infected group and control infected group,7/10 on day 4,2/7 on day 7 but 0 on day 14 in the MPA-pretreated infected group.Fisher's exact test revealed that the culture-positive rate of Ct was significantly higher in the MPA-pretreated infected group than in the control infected group and CNE-pretreated infected group on day 4（bothP=0.03）,but similar among the three infected groups on day 7 （P=0.23）.Both the MPA-pretreated control group and infected group showed an increase in endovaginal mucus,thinning of vaginal stratified squamous epithelium,mucification of vaginal epithelium,presence of secretions in vaginal lumen and submucosal infiltration of a few inflammatory cells on day 4,7 and 14,as well as appearance of pathological changes（including the presence of large quantities of purulent secretions in lumen,mild tissue edema and submucosal infiltration of a few inflammatory cells）in the vagina on day 4.Vaginal tissues were normal in both the CNE-pretreated infected group and control group at the above three time points,but mild tissue edema,lumen expansion,secretion retention and infiltration of scattered inflammatory cells were observed in the uterus on day 4 after inoculation.Conclusions MPA can arrest the estrous cycle of mice at diestrus with the mucification of vaginal epithelium,which may increase the susceptibility to Ct vaginal infection in mice.In contrast,CNE has no obvious effect on the estrous cycle and susceptibility to Ct vaginal infection despite of the appearance of pathological changes in the uterus.

Medroxyprogesterone acetate;Norethindrone;Chlamydia trachomatis;Disease models,animal;Mice;Reproductive tract infections

Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

作者單位：210042南京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所，中國疾病預防控制中心性病控制中心

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.005

國家十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題（2012ZX09301002005）；協(xié)和青年基金（33320140135）

尹躍平，Email：yinyp@ncstdlc.org

2014-04-24）

（本文編輯：尚淑賢）