楊林，石紅霞，薛鴻燕，周小凱，劉曉風

（1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌、抗氧化活性研究

楊林1，石紅霞1，薛鴻燕1，周小凱1，劉曉風1

（1.蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

紫薯具有很高的營養(yǎng)價值，且含有豐富的內(nèi)生菌，是抑菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源。本研究采用濾紙片法和紫外分光光度法對紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，進行體外抑菌和抗氧化實驗。實驗結(jié)果表明：紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸乙酯萃取部位抑菌活性最強，正丁醇部位活性強于菌體甲醇提取部位，其中，菌株ZS107的乙酸乙酯部位對革蘭氏陰性菌具有極顯著的抑菌活性；抗氧化實驗，結(jié)果表明ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位Vc當量大于100mg/mL，ZS204的乙酸乙酯部位樣品的DPPH自由基清除能力明顯高于其他樣品，清除羥基自由基能力較弱。紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物，具有較好的抗菌及一定的抗氧化等活性，具有較高的研究價值。

紫薯 內(nèi)生真菌 抑菌 抗氧化

紫薯（Solanum tuberodsum L.），為旋花科甘薯屬草本植物，俗稱紫山芋、黑薯，薯肉為紫色至深紫色，又稱黑薯。具有通便、防癌、抗癌、清除自由基、抗衰老、抗突變、改善肝功能、降血壓、預防動脈硬化等功能，是當前首推的無公害、綠色、有機保健食品［1］。目前對紫薯的研究都集中在對紫薯色素的提取及性質(zhì)研究以及對紫薯花青素的研究，而對紫薯內(nèi)生菌的研究尚未見報道。本研究結(jié)果表明，紫薯中含有較為豐富的內(nèi)生真菌，是抗菌及抗氧化等活性物質(zhì)的重要來源，為進一步從紫薯內(nèi)生菌中分離篩選新藥先導化合物提供了科學依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

內(nèi)生真菌 于2014年，從新鮮無病害的紫薯塊莖中分離得到的14株內(nèi)生真菌，菌種保存于蘭州理工大學生命科學實驗中心。

試劑 DPPH（Aladdin chemistry Co.Ltd，96%，批號46046）、維生素C、水楊酸、無水乙醇、30% 過氧化氫，硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫、三氯乙酸、氯化鐵等試劑均為分析純。

儀器 AB104-N電子天平（Mettle-Toledo）；ES-2002H電子天平（長沙湘平）；CARY 50 Probe UV-Visible spectrophotometer （VARIAN Australia RTY LTD），RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮），SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

指示菌：G+性菌：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、乳鏈球菌（Streptococcus uberi）和G－性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），菌種引自蘭州理工大學生命科學實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 代謝產(chǎn)物的發(fā)酵及處理

內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)活化3天，后接種于含200mL PDB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶內(nèi)。置于轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中28℃下培養(yǎng)兩周。發(fā)酵結(jié)束后，將菌體與菌液離心分離。菌液依次用等體積的乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分別合并有機相并回收溶劑，得乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位；菌體50℃烘箱干燥，研缽研磨均勻后，用30倍體積甲醇回流提取3次，每次1h，過濾，濾液回收甲醇，得菌體甲醇提取部位。各于50℃干燥至恒重，備用［2］。

1.2.2 抑菌活性測定

抑菌活性測定采用濾紙片法［3］。樣品用DMSO配制成5mg/mL樣液。調(diào)節(jié)菌體濃度至106CFU/mL，取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，并將直徑5mm的無菌濾紙片置于帶菌平板上，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，后用微量移液器吸取15μL樣液滴于紙片上，溶劑DMSO為陰性對照，10U的硫酸鏈霉素或25U的青霉素鈉為陽性對照，每個樣品設(shè)3個平行。于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測定各樣品抑菌圈的大小。并對有較好抑菌效果的樣品使用二倍稀釋法［73］進行最小抑菌濃度的測定，樣品用DMSO稀釋為5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL濃度。

1.2.3 抗氧化活性測定

總還原力的測定 采用鐵氰化鉀還原法。將樣品用DMSO配成1mg/mL溶液，取樣液2.5mL，依次加入0.2mol/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL和l%鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液2.5mL。50℃水浴中保溫20min后快速冷卻。再加10%三氯乙酸溶液2.5mL（如有沉淀離心除去），取上清液2.5mL，依次加入蒸餾水2.5mL和0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，振蕩混勻，靜置10min后，在700nm處測定其吸光度值，同時以陽性對照Vc做標準曲線，算出樣品Vc當量［4］。

DPPH自由基清除活性的測定 采用水楊酸法，將樣品用DMSO配成0.05mg/mL溶液。在同一具塞試管中加入0.025mg/mL的DPPH·乙醇溶液和樣品溶液各2mL，搖勻，室溫避光靜置30min，用無水乙醇作參比溶液，在5l7nm處測量吸光度值A(chǔ)樣品。用2mL無水乙醇代替樣品，測定空白吸光度A空白。用2mL無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液，測定吸光度值為A對照［5］。如下公式計算：

羥基自由基清除活性的測定：將樣品用DMSO配成0.8mg/mL溶液。于10mL比色管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵水溶液1mL，6mmol/L的水楊酸·乙醇溶液1mL后，加入1mL樣液，再加0.1%的過氧化氫1mL，用蒸餾水定容，搖勻后于37℃水浴30min， 510nm測吸光度值A(chǔ)樣。用1mLDMSO溶液代替樣品，測定空白吸光度A空白。用1mL水溶液代替H2O2，測定吸光度A對照 。按下式計算：

2、結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測定結(jié)果

42個樣品中有17個樣品對6種指示菌均表現(xiàn)出抑制活性，占總測試樣品的40%；其中乙酸乙酯部位對6種指示菌均有抑制作用的有11個，正丁醇部位有4個，菌體甲醇部位有2個；有5個樣品對6種指示菌有較強的抑制作用（抑菌圈直徑10-20mm），分別是ZS102、ZS112、ZS204、ZS301的乙酸乙酯部位和ZS302的正丁醇部位；ZS107和ZS108的乙酸乙酯部位和ZS101、ZS102的正丁醇部位對6種指示菌均有很強的抑制作用（抑菌圈直徑20-45mm），其中對金黃色葡萄球菌抑制作用最強的為ZS107的乙酸乙酯部位，抑菌圈直徑為35mm，對地衣芽孢桿菌和乳鏈球菌抑制作用最強的為ZS108的乙酸乙酯部位，抑菌圈都為27mm，對大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌抑制作用最強的均為ZS107的乙酸乙酯部位，抑菌圈直徑分別為41mm、42mm、41mm。抑菌試驗數(shù)據(jù)如表1所示：(+++++) <35mm；(++++++)40mm；(+++++++)<45mm③低活性：中<15mm：中等活性1 5mm≤中<20mm：高活性：中≥20 mm

表1 紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定結(jié)果

對抑菌圈直徑大于20mm的樣品進行最小抑菌濃度的測定結(jié)果表明，ZS107的乙酸乙酯部位對肺炎克雷伯菌的抑制效果最強，其最小抑菌濃度為0.15625mg/mL，ZS108的乙酸乙酯部位對地衣芽孢桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度均達到0.15625mg/mL，ZS301的乙酸乙酯部位對地衣芽孢桿菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL；ZS101的正丁醇部位對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL，ZS102的正丁醇部位只有對肺炎克雷伯菌的最小抑菌濃度達到0.15625mg/mL，而ZS302的正丁醇部位除了對乳鏈球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度為2.5mg/mL為對其余4個指示菌的最小抑菌濃度都達到0.15625mg/mL， 最小抑菌濃度測定結(jié)果如表2:

表2 紫薯內(nèi)生真菌最小抑菌濃度MIC測定結(jié)果（mg/mL）

2.2 抗氧化活性測定結(jié)果

2.2.1 總還原力測定結(jié)果

42個樣品中表現(xiàn)出有還原總力的有41個，其中還原能力乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞菌體部位；Vc相當含量超過100的有2個樣品，分別是ZS101和ZS102的乙酸乙酯部位；其中ZS102的乙酸乙酯部位最高，達到129.6μg/mL。如圖1

所示：

圖1 紫薯內(nèi)生真菌總還原力測定結(jié)果

2.2.2 清除DPPH.測定結(jié)果

42個樣品表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性的有26個，占總樣品的61.9%；其中只有ZS204的乙酸乙酯部位的清除率大于50%（84.57%）；其他樣品對DPPH自由基的清除作用均較弱。Vc的清除率為96%。測定結(jié)果如圖2所示：

圖2 紫薯內(nèi)生真菌對DPPH·自由基清除作用測定結(jié)果

2.2.3 清除羥基自由基測定結(jié)果

40個樣品有一定的清除作用，清除率均小于50%，整體清除效果較差。對羥基自由基的清除作用最強的是ZS107的乙酸乙酯部位（40.23%）。整體來看，乙酸乙酯部位樣品清除率高于正丁醇和菌體部位。如圖3所示：

圖3 紫薯內(nèi)生真菌對羥基自由基的清除作用

3、結(jié)果及討論

抑菌實驗結(jié)果表明，大多數(shù)內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對指示菌具有一定的抑菌活性，乙酸乙酯部位抑菌活性強于正丁醇部位，正丁醇部位強于菌體甲醇部位。其中，ZS107的乙酸乙酯部位對3種革蘭氏陰性菌的抑菌效果極明顯，抑菌圈均大于40mm，超過Vc的抑菌圈，有必要對該菌進行進一步研究，有望從中發(fā)現(xiàn)抑菌活性較好的化合物。

抗氧化結(jié)果表明，總還原能力測試中Vc相當含量高的樣品較少，DPPH自由基清除實驗中ZS204的乙酸乙酯部位的清除率較高。對羥基自由基的清除作用不太明顯，說明紫薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性較弱。

本研究為后續(xù)紫薯研究和利用作了一定的鋪墊，也為從紫薯內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中分離得到抗氧化，抑菌作用的化合物提供依據(jù)。

[1]楊巍,黃潔瓊,陳英,王和才,朱慶珍,徐家榮.紫薯的營養(yǎng)價值與產(chǎn)品開發(fā).農(nóng)產(chǎn)品加工學刊[J],2011,253(8):41-42

[2]Verraest, Peter, et al.Modiication of inulin with amidoxime groups and coordination with copper ions [J].Carbohydrate Polymers,1998,37:209-214

[3]張佳,王瑩,張峰.濾紙片法測定黃花蒿提取物對霉菌的抑制活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2009, 48(5):1153-1154

[4]L iang C H, Syu JL, Mau JL.Antioxidant properties of solid-state fermented adlay and rice by Phellinus linteus [J].Food Chemistry,2009,116(4): 841-845

[5]Aruomaoi.Nutrition and health aspects of free radical sand antioxidants [J].Food Chemistry Toxic,1994,32(7):671-683

[6]顏軍,茍小軍,鄒全付等.分光光度法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基[J].成都大學學報(自然科學版),2009,28(2):91-93

[7]Smirnoff N, Cumbes QJ, Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes [J].Phytochemistry,1989,28(4):1057-1060