微生物合成黃酮類化合物的研究進(jìn)展

陳 堅(jiān), 周勝虎, 吳俊俊, 周景文,*, 堵國成

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

微生物合成黃酮類化合物的研究進(jìn)展

陳 堅(jiān)1,2, 周勝虎1, 吳俊俊1, 周景文1,*, 堵國成1,2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

目前，工業(yè)生產(chǎn)黃酮類化合物面臨價(jià)格昂貴等一系列問題，因此用微生物廉價(jià)生產(chǎn)黃酮類化合物具有重要意義。近年來系統(tǒng)代謝工程的出現(xiàn)，提供了一個(gè)全新的角度來解決傳統(tǒng)受限制的生物工業(yè)過程。介紹了利用代謝流調(diào)控、強(qiáng)化前體物質(zhì)積累等代謝工程策略，實(shí)現(xiàn)微生物法生產(chǎn)黃酮類化合物的國際研究狀況，希望對解決目前大規(guī)模生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)存在的限制和挑戰(zhàn)提供參考。

代謝工程；黃酮；骨架物質(zhì)；大腸桿菌；釀酒酵母

黃酮類化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過中央3個(gè)碳原子連接而成的一系列化合物，它是植物的一類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗衰老和抗癌［1-3］、抗菌、抗病毒［2，4-5］、預(yù)防肥胖和糖尿?。?］、抗凝血［7］、抗炎癥、抗過敏［8］等眾多作用。已知的黃酮類化合物有9 000余種，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同可以分為黃酮醇、黃烷酮、黃酮、異黃酮、兒茶酸、花青素等［6］，它們幾乎都有一個(gè)由15個(gè)碳原子組成的核心骨架［9］，通過對核心骨架的烷化、氧化和糖基化等化學(xué)修飾作用可以形成種類眾多的黃酮類物質(zhì)［9-10］。目前工業(yè)生產(chǎn)黃酮類化合物主要是從不同的植物組分中提取，這種生產(chǎn)方法受到季節(jié)和工藝的限制，產(chǎn)品純度不高且價(jià)格昂貴，因此通過代謝工程的手段改造微生物從而合成黃酮類骨架物質(zhì)成為一種具有巨大潛力的生產(chǎn)方式。目前國際上以微生物生產(chǎn)黃酮類化合物的研究主要集中在生產(chǎn)黃酮骨架物質(zhì)上。

1 黃酮類化合物合成路徑

1.1 微生物合成黃酮化合物的代謝路徑

因?yàn)辄S酮類化合物對于人類健康的眾多功用，它的生物合成路徑也得到了充分研究。苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）或酪氨酸（tyrosine，Tyr）在苯丙氨酸脫氨酶（PAL）或酪氨酸脫氨酶（phenylalanine ammonialyase，TAL）作用下變?yōu)槿夤鹚峄蛳愣顾幔夤鹚嵩谝蕾嚰?xì)胞色素P450的4-肉桂酸羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）作用下轉(zhuǎn)化為香豆酸。依賴細(xì)胞色素P450的C4H需要錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并且必須有還原劑隨時(shí)將氧化態(tài)的P450還原［11］才能表現(xiàn)出活性，因此很難在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出有活性的C4H。為了繞過C4H的活性限制，Miyahisa等［12］將來自天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）的香豆酸CoA連接酶（4-cinnamate CoA ligase，4CL）與來自深紅類酵母的PAL和來自甘草的查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）導(dǎo)入大腸桿菌（E.coli）表達(dá)，最終得到了較高的骨架物質(zhì)產(chǎn)量。4CL可以同時(shí)作用于肉桂酸和香豆酸［13］生成肉桂酰-CoA和香豆酰-CoA，因此可以繞開由苯丙氨酸合成黃酮骨架物質(zhì)的限制。

CHS將三分子丙二酰-CoA和一分子4-肉桂酰-CoA/4-香豆酰-CoA轉(zhuǎn)化為生松素查爾酮/柚皮素查爾酮，最后在查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerose，CHI）作用下，獲得生松素/柚皮素［14］，芪合酶（stillbene synthase，STS）以4-香豆酰-CoA為底物結(jié)合三分子丙二酰-CoA合成白黎蘆醇（如圖1）。柚皮素和生松素在依賴細(xì)胞色素P450的異黃酮合成酶（isoflavone synthase，IFS）轉(zhuǎn)化為異黃酮，在黃酮合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)SI）或者依賴細(xì)胞色素P450的黃酮合成酶（FSII）作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟鹃夭菟睾颓埸S素［15］。

圖1 黃酮類化合物合成路徑Fig.1 Flavonoids'metabolic pathway

1.2 TAL在微生物合成黃酮類化合物過程中的抑制機(jī)理

不同來源的酶在微生物中表達(dá)活性和翻譯效率也是不一樣的，因此Santos等［14］對合成黃酮骨架物質(zhì)的基因來源做了一定的對比和選擇。他們對比了多種來源的TAL酶在E.coli中的催化效率，最終選擇了來自黏紅酵母的TAL得到213 mg/L的香豆酸產(chǎn)量，但是當(dāng)把TAL和不同來源的4CL共表達(dá)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)TAL的活性明顯下降，通過導(dǎo)入4CL下游基因發(fā)現(xiàn)這是由于TAL受到下游產(chǎn)物香豆酰-CoA的反饋抑制造成的。TAL抑制機(jī)理的闡明對于后續(xù)的研究方向有一定的影響，如何對菌體的代謝流進(jìn)行調(diào)控來解除反饋抑制成為關(guān)鍵。

2 不同微生物的合成策略

2.1 以E.coli為宿主合成黃酮類化合物

2.1.1 模塊化合成策略

Wu Junjun等［16］根據(jù)功能不同將合成黃酮類化合物相關(guān)的基因分為多個(gè)模塊，對這些模塊內(nèi)基因表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行理性調(diào)節(jié)，有效地提高了骨架物質(zhì)的產(chǎn)量。將合成Phe的相關(guān)基因aroFfbr和pheAfbr，合成肉桂酰-CoA的基因pal和4cl，由肉桂酰-CoA到生松素的chs和chi基因以及丙二酰-CoA的合成基因matB和matC分別組合為4個(gè)模塊，根據(jù)啟動(dòng)子強(qiáng)度和質(zhì)粒的拷貝數(shù)來確定每個(gè)模塊基因的表達(dá)強(qiáng)度，最終得到生松素產(chǎn)量為40.02 mg/L［16］，該研究者應(yīng)用同樣的策略對白藜蘆醇和柚皮素生產(chǎn)進(jìn)行了模塊化優(yōu)化，得到產(chǎn)量分別為35.02 mg/L［17］和100.64 mg/L［18］。

2.1.2 模型優(yōu)化策略

近年來系統(tǒng)代謝工程的發(fā)展使得人們更多地利用系統(tǒng)代謝工程的策略和工具來提高黃酮產(chǎn)量。Fowler等［19］構(gòu)建了CiED（cipher of evolutionary design）模型預(yù)測工具預(yù)測敲除菌體的某些基因或者改變代謝網(wǎng)絡(luò)后菌體的代謝變化，研究者應(yīng)用CiED工具使碳源盡可能流向乙酰-CoA和黃酮骨架物質(zhì)合成的方向，使得柚皮素和圣草酚產(chǎn)量分別提高到100 mg/L/OD和55 mg/L/OD。Xu Peng等［20］利用OptForce工具預(yù)測出敲除fumC和sucC基因，同時(shí)過表達(dá)ACC、PGK、GAPD、PDH酶可以提高菌體內(nèi)丙二酰-CoA的含量，使得菌體由香豆酸開始能夠合成474 mg/L的柚皮素。

2.1.3 增加前體物質(zhì)的策略

咖啡酸、香豆酸和丙二酰-CoA是黃酮骨架物質(zhì)的直接前體，添加或提高它們的產(chǎn)量可以有效增加黃酮骨架物質(zhì)的合成。研究者發(fā)現(xiàn)E.coli的4-羥基苯乙酸酯3-羥化酶（4-hydroxy benzene acetic acid ester 3-hydroxylase，4HP3H）可以催化香豆酸合成咖啡酸［21］，成功地繞開了細(xì)胞色素P450酶香豆酸3-羥化酶（C3H）的限制，他們在酪氨酸高產(chǎn)菌株中獲得了50.2 mg/L的咖啡酸產(chǎn)量。隨后在以香豆酸為底物的條件下獲得了3.82 g/L的產(chǎn)量，在Phe和Tyr均高產(chǎn)的菌株中得到766.68 mg/L的產(chǎn)量［22］。Kang等［23］在高產(chǎn)酪氨酸E.coli內(nèi)以葡萄糖為底物得到974 mg/L香豆酸、150 mg/L咖啡酸。

細(xì)胞內(nèi)較低的丙二酰-CoA含量是導(dǎo)致骨架物質(zhì)產(chǎn)量較低的重要原因，將來自于谷氨酸棒狀桿菌的乙酰-CoA羧化酶（ACC）置于表達(dá)質(zhì)粒上，導(dǎo)入E.coli有效提高了黃酮產(chǎn)量［12］。Leonard等［24］共表達(dá)來自發(fā)光光桿狀菌的ACC以及生物素連接酶，融合表達(dá)來自E.coli和發(fā)光光桿狀菌的生物素連接酶，增強(qiáng)菌體對乙酸鹽的吸收能力。以Phe為底物使得生松素、柚皮素和圣草酚產(chǎn)量分別提高到429，119，52 mg/L。隨后他們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入三葉草根瘤菌的丙二酰-CoA合成途徑以及利用淺藍(lán)菌素來抑制脂肪酸代謝途徑能再次提高骨架物質(zhì)產(chǎn)量，在以Phe為底物的條件下生松素產(chǎn)量達(dá)到700 mg/L［25］。此外，Lim等［26］通過篩選不同植物里的STS基因，利用不同的啟動(dòng)子，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和宿主來優(yōu)化白黎蘆醇途徑，在添加了淺藍(lán)菌素抑制脂肪酸合成的情況下產(chǎn)量提高到2.3 g/L。

2.2 以S.cerevisiae為宿主合成黃酮類化合物

釀酒酵母沒有致病性并且已經(jīng)應(yīng)用于食品科學(xué)領(lǐng)域，與細(xì)菌相比，S.cerevisiae可以對翻譯之后的蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)修飾，多用于真核生物相關(guān)基因的異源表達(dá)。以S.cerevisiae為宿主可以表達(dá)出有活性的P450羥化酶（C4H），合成黃酮類化合物的過程中有多個(gè)步驟涉及P450酶［15］，因此S.cerevisiae成了一個(gè)良好的生產(chǎn)菌種。

Jiang等［27］首次用S.cerevisiae合成出了黃酮類化合物，他們共表達(dá)了PAL、4CL、CHS三種酶，在添加Phe/Tyr的條件下得到生松素和柚皮素的產(chǎn)量分別為0.8 mg/L和7 mg/L。隨后Yan Yajun等在S.cerevisiae中共表達(dá)C4H、4CL、CHS、CHI四種酶，并以苯丙氨酸為底物合成黃酮類物質(zhì)最終得到柚皮素、生松素、圣草酚的產(chǎn)量分別為28.3，16.3，6.5 mg/L［15，28］，進(jìn)一步提高了產(chǎn)量。還有研究者用隨機(jī)拼接構(gòu)建人工酵母染色體的方法，以天然或非天然的底物生產(chǎn)黃酮類化合物，發(fā)明了一種構(gòu)建全代謝路徑工程菌的方法［29］。2010年，Werner等［30］指出，用S.cerevisiae還可以生產(chǎn)自然界中不存在的非天然黃酮類化合物，他們以22種肉桂酸衍生物為底物，用含有4CL、CHS酶的菌株生產(chǎn)非天然黃酮類物質(zhì)獲得了成功。

2.3 以委內(nèi)瑞拉鏈霉菌為宿主合成黃酮類化合物

2009年，Park等［31］首次報(bào)道了以委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（streptomyces venezuelae）為宿主的生產(chǎn)策略。研究者用敲除苦霉素聚酮合酶的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌為宿主，共表達(dá)來自天藍(lán)色鏈霉菌的4-香豆酸CoA連接酶（4CL）、不同來源的CHS以及CHI，最終成功合成了黃酮骨架物質(zhì)。隨后，他們在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中導(dǎo)入了matB和matC基因后在外源添加丙二酸鹽的條件下有效地增加了黃酮類化合物的產(chǎn)量，柚皮素35.6 mg/L、生松素44.1 mg/L［32］。

3 工業(yè)生產(chǎn)黃酮類化合物現(xiàn)狀

黃酮類化合物的工業(yè)生產(chǎn)主要是從植物組織中提取得到，目前市場上對黃酮類化合物的需求巨大。工業(yè)生產(chǎn)無法滿足市場需求，主要原因在于植物中有效成分含量較少，例如白藜蘆醇在花生和葡萄中的含量低于4 μg/（g·干重），在紅酒中只有2 mg/L［26］。有藥物活性的黃酮類化合物往往具有手性選擇性，從植物組織中很難分離出單一的有效成分，應(yīng)用有機(jī)溶劑萃取的方法生產(chǎn)黃酮類化合物得到的產(chǎn)品會(huì)有一定的有機(jī)溶劑污染，同時(shí)還會(huì)污染環(huán)境。由于工業(yè)生產(chǎn)原料是植物組織，其生產(chǎn)受到季節(jié)的限制，并且由于植物的生長地域不同，應(yīng)用同一提取方案最終提取到的黃酮化合物也會(huì)有不同的成分殘留，如重金屬等，正是由于工業(yè)生產(chǎn)上的諸多限制才導(dǎo)致了黃酮價(jià)格昂貴。

4 結(jié)束語

盡管目前利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)仍然有一段路要走，但近年來合成生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展給人們提供了一個(gè)有效的工具來改造生物系統(tǒng)。人類在合成生物學(xué)上取得的巨大進(jìn)展極大地提高了我們設(shè)計(jì)、構(gòu)建以及優(yōu)化微生物細(xì)胞工廠的能力［33］。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，我們相信在不久的將來，合成的細(xì)胞工廠終能克服目前大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的固有缺陷。除了上述的合成生物學(xué)策略和工具以外，一些用來生產(chǎn)其他天然產(chǎn)物的策略和方法對于我們開發(fā)出有效的黃酮微生物生產(chǎn)方法也具有一定的啟發(fā)意義。例如一些先進(jìn)的DNA組裝工具提供了構(gòu)建多基因途徑從頭合成黃酮骨架物質(zhì)的有效方法［20］。常用的工具包括SLIC、CPEC以及ePathBrick質(zhì)粒，它們都可以提供一個(gè)一步無痕的方法來構(gòu)建復(fù)雜的途徑。在眾多DNA組裝工具中，ePathBrick質(zhì)粒因擁有的分布在關(guān)鍵位置的4個(gè)可兼容的酶切位點(diǎn)，使得研究者可以更好地研究細(xì)胞代謝。另外，越來越多模擬細(xì)胞代謝的研究會(huì)發(fā)展出新的計(jì)算機(jī)工具，來鑒定出遺傳操作目標(biāo)［34］。通過使用這些工具，我們有望構(gòu)建出特制的細(xì)胞工廠來大規(guī)模生產(chǎn)黃酮骨架物質(zhì)以及其他天然產(chǎn)物。

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Research Progress on Microbial Production of Flavonoids

CHEN Jian1，2， ZHOU Shenghu1， WU Junjun1， ZHOU Jingwen1，*， DU Guocheng1，2
（1.School of Biological Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Flavonoids are plant secondary metabolites，which are valuable natural products widely used in human health and nutrition due to its biochemical properties such as antiviral，antiobesity，and anticancer.The efficient production of pure flavonoid compounds through plant extraction or chemical production continues to be a major challenge for drug development.Hence，the microbial production of flavonoids has emerged as an interesting and commercially attractive approach.The emergence of systems metabolic engineering offers new perspectives on strain and process optimization.In this review，the strategies of systems metabolic engineering used to overcome these challenges are summarized，which will offer insights into overcoming the limitations and challenges of large-scale microbial production of these important pharmaceutical compounds.

metabolic engineering；flavonoids；skeleton substance；Escherichia coli；Saccharomyces cerevisiae

葉紅波）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.01.001

2095-6002（2015）01-0001-05

陳堅(jiān)，周勝虎，吳俊俊，等.微生物合成黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（1）：1-5.

CHEN Jian，ZHOU Shenghu，WU Junjun，et al.Research progress on microbial production of flavonoids［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（1）：1-5.

2014-08-21

國家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB720802）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31370130）；江蘇省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（BK2011004）。

陳 堅(jiān)，男，教授，博士，江南大學(xué)校長，主要從事發(fā)酵工程和食品生物技術(shù)方面的研究；

*周景文，男，副教授，博士，主要從事代謝工程和微生物生理學(xué)方面的研究。

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專家論壇專欄