曾志 王霞 張丹 魏睦新

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，江蘇南京 210029）

貓人參醇提取物對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

曾志1，2王霞2張丹2魏睦新1，2

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，江蘇南京 210029）

目的：探討貓人參醇提取物對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。方法：制備貓人參醇提取物。以人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞株為研究對(duì)象，將不同濃度的貓人參醇提取物作用于SGC-7901細(xì)胞，通過(guò)CCK8法檢測(cè)貓人參醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。采用DAPI熒光染色，觀察經(jīng)100mg/mL貓人參醇提取物處理后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，經(jīng)貓人參醇提取物100、200mg/mL作用12、24、48h后，SGC-7901細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)100mg/ml貓人參醇提取物處理24h后SGC-7901細(xì)胞貼壁疏松，密度變低，細(xì)胞變扁長(zhǎng)，形狀不規(guī)則，經(jīng)過(guò)DAPI染色后可見(jiàn)細(xì)胞核邊緣殘缺，染色質(zhì)聚集，并伴有細(xì)胞核固縮或斷裂現(xiàn)象及出現(xiàn)凋亡小體。結(jié)論：貓人參醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞7901增殖具有抑制作用，是具有治療前景的抗腫瘤藥物。

貓人參 植物提取物 胃癌 SGC-7901 細(xì)胞增殖 病理學(xué)

胃癌是臨床上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。每年世界范圍內(nèi)近100萬(wàn)人被診斷為胃癌，70萬(wàn)人死于胃癌［1］，致死率高于其他臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，排在我國(guó)惡性腫瘤和致死因素的第四位［2］。貓人參是獼猴桃科植物對(duì)萼獼猴桃（Actinidia valvata）或大籽獼猴桃（A.macrosperma）的干燥根及粗莖，其中對(duì)萼獼猴桃產(chǎn)自安徽、浙江、湖北、湖南等省份，福建省建寧等地亦有分布，大籽獼猴桃產(chǎn)于廣東、湖北、江西、浙江、江蘇、安徽等省份［3］。在民間，貓人參用于治療深部膿腫、骨髓炎、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍腫毒等常見(jiàn)外科疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床主要用其治療消化道腫瘤、原發(fā)性肝癌以及肺癌［4］。既往研究表明，單味貓人參注射液對(duì)肝癌、白血病及結(jié)腸癌細(xì)胞株有一定的抑制作用，從貓人參中提取分離而來(lái)的葸醌類和皂苷類的復(fù)合物均被證實(shí)有抗腫瘤活性，能夠抑制小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)貓人參醇提取物作用于SGC-7901細(xì)胞，探討其抗癌作用和機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清FBS及胰酶蛋白（HyClone公司），人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），CCK8（Gibco公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK8試劑盒（碧云天生物科技有限公司），磷酸鹽緩沖液PBS（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。貓人參醇提取物參考張亞妮等［5］的提取方法，由江蘇省醫(yī)藥公司提供。

1.2 儀器酶標(biāo)儀（美國(guó)，Thermo Scientific Multiskan FC），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo Fisher），倒置相差顯微鏡（德國(guó)，徠卡DM500/DM750顯微鏡），96孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司），Mill-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 貓人參醇提取物的備制取貓人參藥材粗粉20kg（本研究所使用的貓人參產(chǎn)自江蘇省，選用大籽獼猴桃干燥根及根莖部分），購(gòu)自江蘇省藥物研究所，經(jīng)江蘇省藥物研究所鑒定，符合《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》。貓人參粗粉用8倍體積80%乙醇作為提取溶劑回流提取3次，每次1h，合并提取液，濾過(guò)得醇提取液，減壓回收溶劑得浸膏。將浸膏冷凍干燥呈粉末，精密稱取干燥粉末，用培養(yǎng)基制成10mg/mL母液，過(guò)0.22μm微孔濾器過(guò)濾除菌，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901在含10%的胎牛血清1640、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，并置于37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存活率選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，每孔接種100μL細(xì)胞懸液于96孔板中，置于37℃、5%CO2孵育箱中過(guò)夜，至細(xì)胞完全貼壁，分別加入貓人參醇提取物稀釋液，濃度分別為50、100、200mg/mL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h［6］。終止培養(yǎng)前1h，每孔加入100μL CCK8溶液，混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h后，棄上清，加入PBS，室溫低速震蕩10min，待結(jié)晶物溶解后，以酶標(biāo)免疫測(cè)定儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm處的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 DAPI染色觀測(cè)腫瘤細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化將對(duì)數(shù)期SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，加入終濃度為100mg/mL的貓人參醇提取物，對(duì)照組用等體積的PBS代替，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，等預(yù)冷的PBS洗滌后重懸于固定液中30min，之后將懸液低速離心，收集沉淀，用同樣緩沖溶液洗滌2次后將細(xì)胞懸液滴在載玻片上，用2g/mL的DAPI避光染色15min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用方差分析。組間兩兩比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度貓人參醇提取物作用不同時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞生存率的影響見(jiàn)表1。100、200mg/mL貓人參醇提取物作用12、24、48h后，腫瘤細(xì)胞SGC-7901存活率明顯低于PBS對(duì)照組（P＜0.05），50mg/mL貓人參醇提取物降低腫瘤細(xì)胞存活率的效果不明顯，提示貓人參醇提取物對(duì)SGC-7901存在濃度—效應(yīng)關(guān)系。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，貓人參醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC-7901增殖的抑制作用越強(qiáng)。

表1 貓人參醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC-7901存活率的影響%

3.2 貓人參醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，貼壁情況較好，處于正常對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段；而經(jīng)過(guò)100mg/mL貓人參醇提取物處理24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了較大變化，貼壁疏松，密度變低，細(xì)胞變扁長(zhǎng)，形狀不規(guī)則。由圖2可見(jiàn)，經(jīng)DAPI染色后，100mg/mL貓人參醇提取物處理24h后腫瘤細(xì)胞核邊緣殘缺，染色質(zhì)聚集，并伴有細(xì)胞核固縮或斷裂現(xiàn)象及出現(xiàn)凋亡小體，為細(xì)胞凋亡的典型特征；對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核近似橢圓形，邊緣較清晰，染色均勻。

圖1 各組SGC-7901細(xì)胞（×100）

圖2 DAPI熒光染色后各組SGC-7901細(xì)胞形態(tài)（×200）

4 討論

中醫(yī)藥對(duì)于腫瘤的治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如減輕放化療毒副反應(yīng)、治療并發(fā)癥等。貓人參作為民間及民族常用中藥，文獻(xiàn)報(bào)道其有一定的抗腫瘤作用［7］。浙江大學(xué)對(duì)貓人參有效成分研究發(fā)現(xiàn)，其中富含人體所需的各種無(wú)機(jī)元素，根莖部位含有豐富的氨基酸，特別是一些具有特殊生理活性的氨基酸含量較高，貓人參乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分得24-三羥基-12烯-齊墩果烷、積雪草酸、兒茶素、isotachioside、表兒茶素、熊果酸、胡蘿卜苷、β-谷甾醇等有效成分。文獻(xiàn)報(bào)道從貓人參中提取的單體化合物科羅索酸（CRA）在體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、K-562白血病細(xì)胞、人宮頸腺癌Hela細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞SNU-601等具有明顯抑制作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8-9］。

本研究采用人胃癌SGC-7901細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察了貓人參醇提取物對(duì)其增殖的抑制作用以及對(duì)其形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果顯示，貓人參醇提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖有較明顯的抑制作用，且作用程度與濃度、作用時(shí)間相關(guān)。DAPI熒光檢測(cè)到SGC-7901細(xì)胞在貓人參醇提取物的作用下，形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征。下一步擬從細(xì)胞凋亡角度進(jìn)一步闡明胃癌中醫(yī)理論本質(zhì)，揭示貓人參醇提取物對(duì)胃癌的作用機(jī)制及有效靶點(diǎn)。

［1］王霞，魏睦新，劉皓，等.貓人參提取物對(duì)亞硝基胍誘發(fā)的胃癌發(fā)生的預(yù)防作用.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（11）：2649

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R282.710.5

A

1672-397X（2015）10-0077-03

曾志（1989—），女，碩士研究生，中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)中西醫(yī)結(jié)合消化方向。

魏睦新，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。weimuxin@njmu.edu.cn

2015-07-01

編輯：吳寧

江蘇省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目（YB2015163，LZ13247）