董 毅， 朱紹華， 張 瑩*， 張 帆,3， 黃志強(qiáng)， 陳 波

(1.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410004； 3.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

銀杏葉中蘆丁含量快速定量數(shù)學(xué)模型的建立

董 毅1,2， 朱紹華1， 張 瑩1*， 張 帆1,3， 黃志強(qiáng)1， 陳 波2

(1.湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院， 湖南 長沙 410004； 2.湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410004； 3.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

利用傅里葉變換近紅外透射光譜收集了19批不同產(chǎn)地銀杏葉樣品的近紅外光譜圖，運(yùn)用OPUS 6.5分析軟件對(duì)其進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)和多元散射校正預(yù)處理。在7500～6099cm-1和5450～4249cm-1范圍內(nèi)，因子數(shù)選擇7，采用偏最小二乘法(PLS)對(duì)蘆丁的含量進(jìn)行了快速定量測定，根據(jù)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定的蘆丁含量結(jié)果，建立了銀杏葉中蘆丁含量的定量數(shù)學(xué)模型。近紅外模型預(yù)測結(jié)果與色譜檢測結(jié)果相吻合，模型均方差為0.194，預(yù)測集的平均回收率為98.40%。本方法快速、簡便，可應(yīng)用于銀杏葉藥材的質(zhì)量控制和大批量產(chǎn)品的檢測。

近紅外光譜； 銀杏葉； 蘆??； 定量模型

銀杏葉是我國特產(chǎn)的銀杏科銀杏屬植物銀杏(GinkgobilobaL.)，又稱之為公孫樹的干燥葉[1-2]，其主要活性成分總黃酮類化合物以及二萜內(nèi)酯憑借良好的清除自由基、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂和血糖等藥理功效廣泛地應(yīng)用于記憶障礙、糖尿病、外周血管疾病、腦功能障礙等疾病的臨床治療[3-7]。

現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)對(duì)銀杏葉提取物質(zhì)量的控制主要通過測定水解后產(chǎn)生的總黃酮醇苷來實(shí)現(xiàn)，蘆丁、槲皮素等水解前的重要化學(xué)成分的質(zhì)量控制卻難以實(shí)現(xiàn)，往往只能通過人為的添加來達(dá)到現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的要求，以次充好，從而影響了中成藥的成品質(zhì)量[8-9]。目前銀杏葉提取物中活性成分總黃酮的質(zhì)量控制的分析方法主要有紫外分光光度計(jì)法[10]、高效液相色譜法[11-12]等，這些傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行測定前通常需要對(duì)銀杏葉樣品進(jìn)行繁冗的前處理，不僅費(fèi)時(shí)，檢測成本也較高，滿足不了生產(chǎn)過程檢驗(yàn)中簡便、快速的需求。近年來，近紅外光譜技術(shù)作為一種快速分析技術(shù)在產(chǎn)品質(zhì)量控制過程中廣泛受到關(guān)注，該技術(shù)具有無需復(fù)雜樣品前處理步驟、操作簡便、分析速度快、成本低廉、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在銀杏葉等中藥材生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制的應(yīng)用前景十分廣闊[13-16]。

我們以全國19個(gè)不同產(chǎn)地的銀杏葉為研究對(duì)象，在采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀杏葉中蘆丁含量的基礎(chǔ)上，應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合OPUS 6.5分析軟件，利用近紅外光譜與色譜檢測值，建立了銀杏葉中蘆丁含量的快速定量數(shù)學(xué)模型。

1 儀器、材料與試劑

LCMS — 8040超高效液相色譜 — 三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，ESI源(日本島津公司) ；MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，配置樣品旋轉(zhuǎn)臺(tái)；SB — 5200DT超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)； UNIVERSAL320 高速冷凍離心機(jī)(德國Hettich公司)；MILLI — Q去離子水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào): 0080 — 9705供含量測定用)，購于中國藥品生物制品鑒定所；乙酸、乙腈為色譜純；乙醇為分析純。

19批銀杏葉為2014年4月至2014年9月期間收集于湖南、湖北、廣西、陜西等地(具體產(chǎn)地見表1)，經(jīng)粉粹后，過100目篩，備用。

2 超高效液相色譜法測定銀杏葉中的蘆丁含量

樣品前處理方法: 準(zhǔn)確稱取銀杏葉粉0.2g(精確至0.001g)于15mL具塞刻度離心管中，加入10mL 70%乙醇水溶液，超聲萃取30min，靜置，將上清液轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，下層殘?jiān)儆?0mL 70%乙醇水溶液按前面的步驟提取一次，離心分離后，合并兩次提取液并準(zhǔn)確定容至刻度線。搖勻后，取1.0mL以10000r/min離心5min后，取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，待上UPLC — MS/MS分析。

UPLC — MS/MS分析條件：色譜柱: Shim-pack XR-ODSⅢ柱(2.0mm×75mm，1.6 μm)。流動(dòng)相A∶0.1%乙酸，流動(dòng)相B∶乙腈。梯度洗脫程序： 0～1 min，10% B～20% B；1～2.5min，20% B～35% B；2.5～5min，35% B～80% B；5～5.5min，80% B～95% B；5.5～8min，9.5% B～10% B；流速：0.3mL/min。柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5.0μL。離子源：ESI，負(fù)離子掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源接口電壓：3.5kV；DL管溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃。蘆丁定量離子對(duì)m/z 為609.2>300.25；定性離子對(duì)為m/z 609.2>270.90。

3 銀杏葉樣品近紅外光譜的采集

將制好的粉末樣品置于樣品杯內(nèi)，樣品裝至杯子的1/3～1/2處，樣品杯放于旋轉(zhuǎn)臺(tái)上，采用積分球掃描樣品，得到其近紅外光譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)值與光譜間的關(guān)系，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。本試驗(yàn)設(shè)置的儀器工作參數(shù)為：光譜采集范圍4000～12500 cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)：32次；開機(jī)預(yù)熱光譜儀1h后，進(jìn)行樣品掃描，得到19個(gè)樣品的近紅外吸收光譜。

4 校正集和預(yù)測集樣本蘆丁含量的測定

從收集的19個(gè)樣品中選取3個(gè)樣品(河南洛陽、廣西柳州、上海)作為預(yù)測集樣本，其他16個(gè)樣品作為校正集樣本，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定的19個(gè)銀杏樣品的蘆丁含量作為標(biāo)準(zhǔn)值，結(jié)果見表1。

表1 銀杏葉樣品中蘆丁含量的測定值Tab.1 ThedeterminationresultsofrutininGinkgobilobaleafsamples編號(hào)產(chǎn)地蘆丁(mg/g)校正集1湖南長沙0.0323校正集2廣西桂林0.0949校正集3湖南岳陽0.1539校正集4陜西西安0.3174校正集5廣東廣州0.3827校正集6甘肅隴南0.4322校正集7浙江杭州0.4835校正集8安徽黃山0.5178校正集9湖北武漢0.5194校正集10江蘇南京0.6049校正集11北京0.6443校正集12湖南婁底0.6603校正集13重慶0.6899校正集14遼寧大連1.1623校正集15湖南邵陽0.6658校正集16湖南湘西0.0640預(yù)測集1河南洛陽1.0450預(yù)測集2廣西柳州1.3325預(yù)測集3上海0.5287

5 數(shù)學(xué)模型建立

5.1 以銀杏校正集樣本建立數(shù)學(xué)模型

5.1.1 偏最小二乘法原理 根據(jù)一般模型，量測矩陣Y與樣品內(nèi)在信息矩陣C如濃度有如下關(guān)系：

Y=CB

B為系數(shù)矩陣。

偏最小二乘法不但對(duì)量測矩陣Y進(jìn)行正交分解，而且在分解Y的同時(shí)將濃度矩陣C也進(jìn)行正交分解。

Y=T*Vt*+Ey，C=R*Qt*+Ec

在進(jìn)行同時(shí)分解時(shí)，考慮了矩陣T*和矩陣R*之間應(yīng)有的線性關(guān)系，這就構(gòu)成了偏最小二乘法的主要特點(diǎn)，即在分解矩陣Y時(shí)考慮矩陣C的因素，而在分解矩陣C時(shí)考慮矩陣Y的因素，交互效驗(yàn)相互影響，通過迭代時(shí)交換迭代矢量而使兩個(gè)分解過程合二為一。

5.1.2 偏最小二乘回歸模型的建立 采用MPA傅里葉變換近紅外光譜儀所附帶的OPUS 6.5分析軟件，對(duì)所采集的16個(gè)校正集樣本的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘回歸分析(PLS)。

由于采用的是商業(yè)軟件內(nèi)嵌的方法，模型的建立和優(yōu)化都依賴于商業(yè)軟件的內(nèi)在程序。使用OPUS軟件導(dǎo)入所得到的近紅外光譜數(shù)據(jù)，并分為校正樣品和預(yù)測樣品。再利用軟件中的模型優(yōu)化功能，對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，主要優(yōu)化了近紅外光譜數(shù)據(jù)的選擇波長范圍和光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法，并根據(jù)RMSECV的大小選擇模型優(yōu)化的參數(shù)組合。使用不同的光譜波長范圍和多種光譜處理方法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)一步使用交叉檢驗(yàn)的方法，優(yōu)化模型參數(shù)。經(jīng)過比較，實(shí)驗(yàn)最終確定預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)和多元散射校正，建模光譜范圍為7500～6099cm-1和5 450～4 249 cm-1，能夠有效地減少樣品的不均勻性、隨機(jī)噪聲等因素對(duì)模型建立的影響，建立了銀杏葉近紅外光譜與銀杏葉中蘆丁含量的定量模型(見圖1)。

圖1 樣品近紅外光譜圖(A)和經(jīng)過光譜預(yù)處理后樣品的紅外光譜圖(B)Fig.1 Near-infrared spectra of samples(A) and spectral pretreatment samples (B)

5.2 以銀杏預(yù)測集樣本檢驗(yàn)數(shù)學(xué)模型

以本研究建立的銀杏葉中蘆丁含量的數(shù)學(xué)模型對(duì)選定的3個(gè)預(yù)測集銀杏樣本進(jìn)行測定，預(yù)測結(jié)果見表2，并與色譜檢測結(jié)果相比較，以預(yù)測值與色譜檢測的標(biāo)準(zhǔn)值比值為預(yù)測回收率，可得到預(yù)測集的平均回收率為98.40%。圖2為近紅外模型預(yù)測結(jié)果與色譜檢測結(jié)果之間相關(guān)性，模型均方差為0.194，因子數(shù)為7。預(yù)測集檢驗(yàn)結(jié)果表明上述模型適合銀杏葉中蘆丁含量的測定。

表2 預(yù)測集結(jié)果與色譜檢測結(jié)果Tab.2 ThepredictionresultsofNIRmodelandthedetectionresultsofchromatography銀杏產(chǎn)地色譜檢測結(jié)果模型預(yù)測結(jié)果偏差預(yù)測回收率(%)河南洛陽1.04500.98170.063393.94廣西柳州1.33251.3335-0.0010100.08上海0.52870.5349-0.0062101.17

圖2 近紅外模型預(yù)測結(jié)果與色譜檢測結(jié)果之間相關(guān)性Fig. 2 The correlation between the prediction results of NIR model and the detection results of chromatography

6 結(jié)論與討論

利用近紅外光譜與色譜檢測值，建立了銀杏葉中蘆丁含量的數(shù)學(xué)模型，并用此模型對(duì)銀杏樣品進(jìn)行了預(yù)測，預(yù)測結(jié)果與色譜檢測結(jié)果相吻合，偏差較小，說明模型具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，能夠用于銀杏葉中蘆丁的定量檢測。但由于建立模型所用的樣品數(shù)量較少，且代表性有限，因此需要采集更多有代表性的樣品，以使模型具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和適用性。

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TheestablishmentofthemathematicalmodelofrapiddeterminationofrutininGinkgobilobaleaves

DONG Yi1,2, ZHU Shaohua1, ZHANG Ying1*, ZHANG Fan1,3, HUANG Zhiqiang1, CHEN Bo2

(1.Hunan Academy of Inspection and Quarantine, Changsha 410004, China;2.Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, Hunan Normal University, Changsha 410004, China;3.Changsha Environmental Protection College, Changsha 410004, China)

After collecting the NIR-spectra of 19Ginkgobilobaleaves samples from different origin areas，multiplication signal correction and first derivative were conducted to optimize the original spectra with OPUS 6.5 software. In 7 500～6 099 cm-1and 5 450～4 249 cm-1range inside, the rutin content was quantitative detected quickly with partial least squares( PLS ) by choosing seven principal components, a rutin quantitative mathematical model ofGinkgobilobaleaf based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry results was established. The near infrared model prediction results were matched to the chromatographic detection results, model variance were 0.194 and the average recovery of predict ion samples was 98.40%. This method is rapid and simple, it can be used to quality control ofGinkgobilobamedicinal and high-volume products detection.

near infrared spectroscopy;Ginkgobilobaleaf; rutin; quantitative models

2015-03-06

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012IK161)。

董 毅(1994-)，男，湖南省常德市人，碩士研究生，主要從事食品安全及檢測研究。

* 為通訊作者。

R 284.1; O 657.33

A

1003 — 5710(2015)03 — 0045 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 03. 011

(文字編校：張 珉)