李文媛++劉艷翠++尹國華++馮克儉++王瑩

[摘要]目的探討膠質和鈣結合EGF區(qū)域l（Collagen and calcium binding EGF domains 1，Ccbel）病毒對人喉癌細胞系Hep-2細胞增殖及血管內皮生長因子-C（vessel endothelium growth factor C，VEGF-C）表達的影響。方法用lxl02，lxl04，lxl0⁶pfu/mL的Ccbel腺病毒作用喉癌Hep-2細胞，細胞分為對照組（PBS），Ccbel病毒高、中、低劑量組。觀察各組細胞增殖情況，采用PCR檢測各組細胞VEGF-C mRNA的表達水平。結果與對照組比較，Ccbel病毒各劑量組細胞增殖顯著增高，VEGF-CmRNA表達水平顯著上升，且均有顯著劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論Ccbel病毒可能通過上調淋巴管生成因子VEGF-C表達促進喉癌細胞增殖和淋巴管生成。

[關鍵詞]Ccbel病毒；VEGF-C：喉癌；Hep-2細胞

[中圖分類號]R739.65

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）-0010-03

喉癌是我國東北地區(qū)最為常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤。發(fā)病率高，危害大。近年來，隨著分子生物學和細胞學的發(fā)展，一系列關于喉癌發(fā)病與治療的相關機制得到探討。目前發(fā)現(xiàn)多種淋巴管生成因子參與喉癌的生長與淋巴管轉移，有研究表明Ccbel（膠原和鈣結合蛋白表皮生長因子-域-1）作為新發(fā)現(xiàn)的一種淋巴管生成因子，在斑馬魚胚胎期進行Ccbel基因沉默后，其淋巴管和血管完全喪失。但關于Ccbel對腫瘤細胞的影響尚不清楚。該實驗在2014年3月-2014年6月期間通過觀察Ccbel病毒對喉癌Hep-2細胞增殖及VEGF-C的表達的影響，探討Ccbel對腫瘤細胞淋巴管生成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

實驗時間：2014年3月-2014年6月。胎牛血清（美國Hy-clon公司），CCK-8法（美國Sigma公司），PCR試劑盒（Invitrogen公司）；引物設計（大連寶生物公司）。

1.2 細胞株培養(yǎng)和病毒干預分組

人喉癌細胞株Hep-2（中國科學院上海細胞生物研究所），依據(jù)參考文獻進行培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），至對數(shù)期進行實驗，制成單細胞懸液（4xl0⁵/mL）。Ccbel病毒（Ccbel Adenovirus Mouse，購于美國abm公司，No.80829A），實驗分為空白對照組（PBS），Ccbel低劑量組（lxl0² pfu/mL），Ccbel中劑量組（lxl0⁴pfu/mL），Ccbel高劑量組（lxl0⁶pfu/mL）。

1.3 CCK-8法檢測

取各組單細胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板（每孔100μL），培養(yǎng)48h后加入10μL的CCK-8溶液（sigma公司），常規(guī)CCK-8法檢測，酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測每孔的吸光度值（OD490）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

總RNA提取，采用Pollmann等嗍報道方法進行PCR反轉錄、檢測及熒光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列為：VEGF-C，上游5'-CTACAGATGTGGGGGTTGCT-3'，下游5'-CATCCAGCTCCUGTTTGGT-3'；NF-KB，上游5'-GAAGAAGC-GAGACCTGGA-3'，下游5'-TCCGGAACACAATGGCCA-3'；β-actin，上游5'-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3'，分析方法利用2-AA cr方法。

1.5 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料連續(xù)型變量采用（X±S）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ccbel對Hep-2細胞增殖的影響

培養(yǎng)ld后，與對照組相比，Ccbel各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，中劑量組和高劑量增殖高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），培養(yǎng)3 d和Sd后，Ccbel各干預組增殖增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中Ccbel高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其促進作用呈濃度依賴性（見表1）。

2.2 各組細胞VEGF-C mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，Ccbel病毒低、中、高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中Ccbel病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbel病毒低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，在我國東北地區(qū)發(fā)病率逐年上升，其中近95%患者為鱗狀上皮癌，其細胞系為hep-2細胞，盡管近年來相關治療如激光切除術和化學藥物治療已取得了較大進展，但淋巴管轉移和復發(fā)率仍高達20%，因此，開發(fā)新的有效治療喉癌淋巴管轉移的方法已尤為迫切。

以往研究已經(jīng)證實喉癌中VEGF-C表達上調，但對于VEGF-C在喉癌細胞系方面的研究仍存在爭議翻。VEGF-C能夠選擇性增強淋巴管內皮細胞有絲分裂；刺激內皮細胞增生并促進淋巴管生成；參與淋巴管外基質重塑。到目前為止已有大量的研究證明在胚胎發(fā)育、組織再生和腫瘤的生長過程VEGF-C在淋巴管新生過程中有極其重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白Ccbel是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚、小鼠和人類.Ccbel基因突變導致淋巴管增生和淋巴水腫（Hennekam綜合征），Ccbel促進淋巴管新生并且可能參與腫瘤細胞的增殖。此外，發(fā)現(xiàn)胚胎期在一些組織Ccbel和其他的淋巴管生成因子表達下降，并證實Ccbel能夠獨立調節(jié)淋巴管生成。但Le等發(fā)現(xiàn)Ccbel在卵巢癌細胞株中顯著下調，與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展呈負相關。前期研究證實喉癌中Ccbel表達顯著增高，參與喉癌淋巴管生成和血管生成，該研究從體外實驗探討Ccbel的作用機制。

Jeltsch表明Ccbel是VEGF-C活化的必要條件，VEGF-C信號通路可能是Ccbel作用的重要下游信號通路。該研究CCK-8法結果表明，Ccbel各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，其中3d和5d.Ccbel高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，顯示Ccbel干預組能夠顯著促進喉癌hep-2細胞增殖，并具有濃度依賴性，證實了Ccbel能夠促進Hep-2細胞增殖能力，這與Pollmann等的研究結果相一致。但Ccbel的作用機制目前尚不明確，該研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較.Ccbel病毒各劑量組VEGF-C mRNA表達水平均顯著上升，其中Ccbel病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbel病毒低、中劑量組，高于對照組4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我們推測Cebel可能通過上調VEGF-C信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，該研究證實了Ccbel能夠上調喉癌hep-2細胞中VEGF-C表達，提示Ccbel可能通過活化VEGF-C.促進喉癌細胞增殖和淋巴管轉移。