曹淑中，裘麗珍

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

DNA 聚合酶是催化DNA 合成的酶，在體內(nèi)和體外都具有重要作用：在體內(nèi)，DNA 聚合酶參與DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)；在體外，DNA 聚合酶是重要的工具酶，被應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、DNA 測序等.最早發(fā)現(xiàn)的DNA 聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ［1］，DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)了人們對DNA 復(fù)制和損傷修復(fù)以及DNA 轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控機(jī)制的理解，而PCR 技術(shù)、DNA 測序技術(shù)是分子生物學(xué)必不可少的實(shí)驗(yàn)手段.

根據(jù)蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的相似性，DNA 聚合酶分為A、B、C、D、X、Y、RT 7個(gè)大家族.其中B型DNA聚合酶是與大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅱ同源的一類DNA 聚合酶，典型特征是具有3'－5'外切核酸酶活性和高保真性［2－3］.

PCR 技術(shù)是DNA 聚合酶的重要應(yīng)用，經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸、總延伸等步驟特異性擴(kuò)增并得到大量目的DNA，為研究人員提供了一種簡單有效地獲取目的DNA 的方法［4］.許多PCR 衍生技術(shù)能滿足不同實(shí)驗(yàn)的需求，如熒光實(shí)時(shí)定量PCR、組裝PCR 等［5－6］.不同的DNA 聚合酶具有不同的性能，許多研究致力于尋找和改造得到更好的DNA 聚合酶，以簡化實(shí)驗(yàn)操作和滿足不同科研人員的需要.耐熱性的Taq DNA 聚合酶的應(yīng)用極大地簡化了PCR 的操作步驟，使PCR 的自動化成為可能，同時(shí)也使PCR 技術(shù)真正得到推廣［7］.對DNA 聚合酶改造得到的熱啟動DNA 聚合酶能有效地抑制非特異性擴(kuò)增［8］.Taq DNA 聚合酶E708L及E708W 能提高其對血液和土壤中PCR 抑制物的抵抗能力［9］.

自PCR 技術(shù)問世，研究便發(fā)現(xiàn)PCR 擴(kuò)增DNA 會導(dǎo)致產(chǎn)物DNA 序列的變化即引入突變，影響因素包括：DNA 聚合酶的保真性、PCR 循環(huán)數(shù)和PCR 的反應(yīng)條件.針對引入突變的不同因素，減少DNA 產(chǎn)物突變的方法有：選用高保真性DNA 聚合酶、減少PCR 的循環(huán)數(shù)和選用合適的緩沖液體系［10］.其中，選用高保真性DNA 聚合酶是最優(yōu)的方法，不降低PCR 循環(huán)數(shù)，不降低DNA 產(chǎn)量.

Pfu DNA 聚合酶因具有高保真性而被廣泛應(yīng)用，其具有3'－5'外切核酸酶活性，能校正PCR 過程中錯(cuò)配摻入的核苷酸，突變率為1×10－6，保真性是Taq DNA 聚合酶的8倍［11］.Pfu DNA 聚合酶的聚合酶活性和3'－5'外切核酸酶活性是功能相反的活性，二者的平衡體現(xiàn)在酶的延伸速度和保真性上［12］.Pfu DNA 聚合酶具有較強(qiáng)的3'－5'外切核酸酶活性，因此具有高保真性的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)其延伸速度僅為1～2min／kb，相較于Taq DNA 聚合酶的30～60s／kb慢很多.因此Pfu DNA 聚合酶的應(yīng)用受到了一定的限制，研究提高其延伸速度將使其應(yīng)用更加廣泛，并為科研人員帶來更多的便利.

Pfu DNA 聚合酶具有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是手指結(jié)構(gòu)域、手掌結(jié)構(gòu)域、拇指結(jié)構(gòu)域、外切核酸酶活性結(jié)構(gòu)域和5'端結(jié)構(gòu)域，各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)象的變化導(dǎo)致酶活性的變化.Pfu DNA 聚合酶中存在一些關(guān)鍵位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在酶活性調(diào)節(jié)起著重要作用.Pfu DNA 聚合酶外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)獨(dú)特的保守性的環(huán)，環(huán)中H147E突變使核酸外切酶結(jié)構(gòu)域負(fù)電增強(qiáng)，并吸引拇指結(jié)構(gòu)域向其靠近，阻止了單鏈DNA 與外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而導(dǎo)致了外切核酸酶活性的降低［13］.Pfu DNA 聚合酶同時(shí)具有一個(gè)高度保守的A 基序，影響酶的dNTP結(jié)合能力、動力學(xué)參數(shù)、保真性等，其中Y410V 比野生型表現(xiàn)出更高的保真性，但在底物濃度低時(shí)對dNTP的利用存在缺陷［14］.通過對關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變能提高酶某些方面的性能，但卻可能帶來一些負(fù)面的效果.

DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力是酶一次結(jié)合到DNA 模板上能催化延伸的核苷酸數(shù)目，是影響酶延伸速度的重要因素.DNA 聚合酶與模板DNA 的結(jié)合是酶催化DNA 復(fù)制的重要前提，DNA 聚合酶與雙鏈DNA 結(jié)合區(qū)域的缺失導(dǎo)致酶持續(xù)合成能力的急劇下降，說明酶與雙鏈DNA 結(jié)合的能力是影響酶持續(xù)合成能力的重要因素［15］.提高酶與雙鏈DNA 結(jié)合能力能提高其持續(xù)合成能力和延伸速度.Pfu DNA 聚合酶與熱穩(wěn)定性的非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白Sso7d融合表達(dá)能提高其持續(xù)合成能力及延伸速度.由于Sso7d分子質(zhì)量小，只有7ku，融合表達(dá)后不影響Pfu DNA 聚合酶自身的熱穩(wěn)定性［16］.同時(shí)Sso7d不影響Pfu DNA 聚合酶自身的dNTP 摻入效率，也不影響保真性［17］.

Pfu DNA 聚合酶與Sso7d融合表達(dá)很好地提高了野生型Pfu DNA 聚合酶的性能，但雙鏈DNA 結(jié)合蛋白提高DNA 聚合酶性能的普遍性未知，即其余雙鏈DNA 結(jié)合蛋白能否提高Pfu DNA 聚合酶的性能未知.研究不同雙鏈DNA 結(jié)合蛋白融合表達(dá)提高Pfu DNA 聚合酶的性能，將得到更優(yōu)的Pfu DNA 聚合酶，同時(shí)增加對Pfu DNA 聚合酶改造機(jī)制的了解.按非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白、熱穩(wěn)定、分子質(zhì)量小3個(gè)條件篩選，得到來自古生菌Sulfolobus solfataricus的8ku大小的DbpA 蛋白，是提高Pfu DNA 聚合酶性能的一個(gè)很好的選項(xiàng).本研究旨在了解DbpA 提高Pfu DNA 聚合酶性能的效果，增加對非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白提高DNA 聚合酶性能的機(jī)制和普遍性的認(rèn)識.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli SURE2為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，pT7N10C6為本實(shí)驗(yàn)室保存載體.pET16b.Pfu和pSJS1240購自Addgene.實(shí)驗(yàn)所用限制性內(nèi)切酶、Phusion DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、M13 單鏈DNA、λDNA 均購自NEB 公司.dNTP、D2000DNA marker、500bp DNA ladder等購自天根生化科技（北京）有限公司.鎳柱購自賽默飛世爾科技公司.蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、抗生素等各種化學(xué)藥品均購自生工生物工程（上海）股份有限公司.引物合成、DNA 測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 Pfu DNA 聚合酶基因及DbpA 基因的獲取

根據(jù)Pfu DNA 聚合酶基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物CAATTG－Pfu－GGTACC－CTCGAG經(jīng)MfeⅠ、XhoⅠ雙酶切插入到載體pT7N10C6中.構(gòu)建載體pT7N10C6－Pfu經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定正確后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序.

根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的DbpA（NP＿343206.1）蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到長222bp的DNA序列信息.將DbpA 基因分成小于60nt的正鏈片段DbpA－1、DbpA－2、DbpA－3及兩端的PCR 引物5'－GGTACC－DbpA 和DbpA－GAGCTC－3'，設(shè)計(jì)負(fù)鏈引物DbpA－Bridge－1、DbpA－bridge－2，分別與相鄰兩條正鏈互補(bǔ)并分別互補(bǔ)（圖1）.將引物DbpA－1、DbpA－2、DbpA－3、DbpA－Bridge－1、DbpA－bridge－2（表1）混合再稀釋100倍用作模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到總長240bp的GGTACC－DbpA－CTCGAG，并經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后插入到載體pT7N10C6－Pfu中，得到質(zhì)粒pT7N10C6－Pfu－DbpA，該質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后凝膠電泳鑒定并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序.

圖1 DbpA 基因構(gòu)建Fig.1 DbpAgene construction

表1 載體構(gòu)建引物Tab.1 Primers designed for plasmids construction

1.2.2 蛋白質(zhì)表達(dá)純化

將構(gòu)建好的pT7N10C6－Pfu和pT7N10C6－Pfu－DbpA 分別與pSJS1240共轉(zhuǎn)E.coli BL21（DE3），分別誘導(dǎo)表達(dá)Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶.裂解細(xì)菌，12 000r／min離心，取上清80℃加熱15min，再次離心，上清通過鎳柱進(jìn)行親和純化.純化的Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶經(jīng)SDS－PAGE 檢測，并通過PCR 擴(kuò)增（引物序列見表2）增強(qiáng)性綠色熒光蛋白（EGFP）驗(yàn)證其DNA 聚合酶活性.驗(yàn)證正確的Pfu DNA聚合酶添加等體積甘油并保存于－20℃.

表2 DNA聚合酶性能鑒定用引物Tab.2 Primers designed for character determination of DNA polymerase

1.2.3 內(nèi)切酶污染檢測

配置EGFP擴(kuò)增反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序設(shè)置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃5min；12℃保溫.擴(kuò)增產(chǎn)物EGFP放置于37℃培養(yǎng)箱，每隔24h取樣并于4℃冰箱保存.凝膠電泳檢測EGFP產(chǎn)物條帶變化情況.

1.2.4 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將Pfu DNA 聚合酶稀釋到2×Pfu buffer中，分裝成6管，編號1～6，每管10μL，1～6管分別95℃加熱0，30，60，80，100，120min.配置dNTP、EGFP引物、模板、水反應(yīng)混合液.取10μL 反應(yīng)混合液加入到已加熱的1～6號管中，混勻.6管同時(shí)在一臺PCR 儀中進(jìn)行PCR，程序設(shè)置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃5min；12℃保溫.PCR 產(chǎn)物全部上樣進(jìn)行凝膠電泳.

凝膠成像圖在Image J中進(jìn)行灰度分析，即讀取各泳道PCR 產(chǎn)物的灰度值.以加熱0min產(chǎn)物泳道的灰度值為1，計(jì)算其余各泳道的灰度百分比.作時(shí)間與灰度百分比的變化曲線.

1.2.5 延伸速度實(shí)驗(yàn)

配置EGFP擴(kuò)增反應(yīng)體系，分裝成9管，編號1～9.PCR 程序設(shè)置：95℃預(yù)變性30s；56℃退火20s；72℃延伸，1～9管延伸時(shí)間依次是10，15，20，25，30，35，40，45，50s；12℃保溫.PCR 產(chǎn)物全部上樣進(jìn)行凝膠電泳.

凝膠成像圖在Image J中進(jìn)行灰度分析，即讀取各泳道PCR 產(chǎn)物的灰度值.以最后一個(gè)泳道的灰度值為1，算出前面各泳道的灰度百分比.作時(shí)間與灰度百分比的增長曲線.

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)配置M13擴(kuò)增反應(yīng)體系，含2.5ng M13 單鏈DNA，Eva Green作為染料.反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀CFX96，程序設(shè)置：95℃2min；56℃20s；72℃5s，熒光讀數(shù)，20個(gè)循環(huán).

1.2.7 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

配置EGFP擴(kuò)增反應(yīng)體系，含2×Pfu buffer，分裝成7管，編號1～7，再用不同濃度KCl溶液將2×Pfu buffer稀釋成1×Pfu buffer，KCl終濃度依次是10，30，50，70，90，110，130mmol／L.7管同時(shí)在一臺PCR 儀中進(jìn)行PCR，程序設(shè)置：95℃2min；95℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃5min；12℃保溫.PCR 產(chǎn)物全部上樣進(jìn)行凝膠電泳.

1.2.8 擴(kuò)增效率實(shí)驗(yàn)

配置擴(kuò)增反應(yīng)體系，含50ngλDNA，不同引物分別用以擴(kuò)增0.5，1，2，5，8，10，12，15kb的DNA 片段.所有反應(yīng)體系同時(shí)在一臺PCR 儀中進(jìn)行PCR，PCR 程序設(shè)置：95℃20s；94℃5s，72℃1min，循環(huán)20次；72℃7min；12℃保溫.PCR 產(chǎn)物全部上樣進(jìn)行凝膠電泳.

1.2.9 保真性實(shí)驗(yàn)

采用Pfu DNA 聚合酶、Pfu－DbpA DNA 聚合酶和Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增1.3kb的DNA 片段pLacmRFP.EcoRⅠ和PstⅠ酶切插入片段pLac－mRFP和載體pSB1AK3，凝膠電泳回收，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至SURE2感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp抗性平板，37℃培養(yǎng)18h，4℃放置2h.計(jì)算平板上白色菌落占總菌落數(shù)的比例.同時(shí)利用Pfu DNA 聚合酶和Pfu－DbpA DNA 聚合酶擴(kuò)增5kbλDNA 片段，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序.

2 結(jié)果與分析

2.1 DbpA 基因的獲取與分析

Sulfolobus solfataricus是一類嗜高溫古生菌，生長在火山噴泉中，具有嗜酸性和嗜熱性.DbpA 是其細(xì)胞內(nèi)含量豐富的一種非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白，保護(hù)基因組DNA 免受高溫強(qiáng)酸的影響和破壞.

因無法獲得DbpA 基因的模板，本研究采用引物重疊延伸的方法擴(kuò)增得到DbpA 基因，原理如圖1所示.擴(kuò)增得到的DbpA 序列經(jīng)過酶切和連接后插入到pT7N10C6－Pfu中得到pT7N10C6－Pfu－DbpA，并經(jīng)T7terminator引物測序驗(yàn)證正確.

2.2 蛋白質(zhì)表達(dá)純化結(jié)果與分析

Pfu DNA 聚合酶編碼基因來自于古生菌Pyrococcus furiosus，因其使用了稀有密碼子導(dǎo)致在大腸桿菌中無法表達(dá).pSJS1240 攜帶argU 和ileX 基因，編碼稀有密碼子tRNA ARG 和tRNA ILE，與Pfu DNA 聚合酶編碼基因共轉(zhuǎn)E.coli BL21（DE3）能提高Pfu DNA 聚合酶的表達(dá)水平.

因純化蛋白是DNA 聚合酶，所以將樣品用于PCR 擴(kuò)增EGFP，驗(yàn)證其酶活性.驗(yàn)證正確的Pfu DNA聚合酶在50%甘油中長期保存于－20℃.

2.3 內(nèi)切酶污染檢測結(jié)果與分析

DNA 聚合酶體外純化并主要被用于PCR 擴(kuò)增DNA，因此需要保證無內(nèi)切酶污染.將純化的Pfu DNA 聚合酶用于PCR 擴(kuò)增EGFP，PCR 反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)體系直接置于37℃，每隔24h取樣并4℃保存，凝膠電泳檢測EGFP產(chǎn)物條帶變化.如果存在內(nèi)切酶污染，因隨著酶切時(shí)間的延長限制性內(nèi)切酶會出現(xiàn)星號活性任意切割DNA，EGFP DNA 的量隨37℃放置的時(shí)間延長而減少甚至完全消失.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著37℃放置時(shí)間的延長，EGFP條帶的亮度不隨37℃放置的時(shí)間延長而減弱，說明純化的Pfu DNA 聚合酶中不存在限制性內(nèi)切酶的污染.蛋白純化過程中上清80 ℃加熱15 min使非熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)變性失活，并在隨后的離心中被去除.加之鎳柱親和純化使本研究所用方法純化得到的Pfu DNA 聚合酶不存在內(nèi)切酶污染，并能安全可靠的應(yīng)用于PCR.

圖2 內(nèi)切酶污染檢測Fig.2 Endonuclease contamination determination

2.4 熱穩(wěn)定性結(jié)果與分析

將酶在2×緩沖液中95℃分別加熱0，30，60，80，100，120min，再加入PCR 體系其余組分進(jìn)行PCR擴(kuò)增EGFP.根據(jù)EGFP擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化反應(yīng)酶活性隨加熱時(shí)間的變化，即反應(yīng)出酶的熱穩(wěn)定性.

Pfu DNA 聚合酶都具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，DbpA 的融合未改變Pfu DNA 聚合酶自身的熱穩(wěn)定性，Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性無顯著差異，如圖3所示.

圖3 Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性比較Fig.3 Comparison of thermo stability of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.5 延伸速度結(jié)果與分析

逐步減少PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系的延伸時(shí)間，當(dāng)延伸時(shí)間足夠的情況下，改變延伸時(shí)間PCR 產(chǎn)物的量不變，但當(dāng)延伸時(shí)間不足時(shí)，各循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物延伸不充分，最終導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量隨延伸時(shí)間的減少而減少.PCR 總延伸將延伸不充分的產(chǎn)物全部延伸充分，需要去除這一步操作，消除對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾.本研究設(shè)置了10，15，20，25，30，35，40，45，50s一系列延伸時(shí)間，PCR 擴(kuò)增EGFP，產(chǎn)物全部進(jìn)行凝膠電泳.結(jié)果如圖4所示.對Pfu DNA 聚合酶，延伸時(shí)間45～50s能得到最大產(chǎn)物量，符合其延伸速度1kb／s，隨著延伸時(shí)間的減少，EGFP產(chǎn)物量明顯減少.如圖4定量分析顯示，對Pfu－DbpA DNA 聚合酶，EGFP 產(chǎn)物量隨延伸時(shí)間的減少而減少的速度明顯更慢.所以Pfu－DbpA DNA 聚合酶的延伸速度快于Pfu DNA 聚合酶.

圖4 Pfu與Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度比較Fig.4 Extension rate Comparison of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.6 熒光實(shí)時(shí)定量結(jié)果與分析

M13ssDNA 是一種單鏈DNA，與引物結(jié)合之后延伸得到雙鏈DNA.Eva Green是一種非特異性DNA結(jié)合染料，不與DNA 結(jié)合時(shí)不發(fā)射熒光信號，與DNA結(jié)合之后發(fā)射熒光信號.M13ssDNA 與引物退火后，只進(jìn)行延伸步驟，與DNA 結(jié)合的Eva Green隨延伸的進(jìn)行而增多，熒光信號增強(qiáng).通過CFX96監(jiān)測熒光信號，信號增長速度反應(yīng)酶的延伸速度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度慢于Pfu DNA 聚合酶，如圖5所示，與延伸速度結(jié)果不符（圖4），可能是DbpA 融合表達(dá)得到的Pfu－DbpA DNA 聚合酶對Eva Green敏感導(dǎo)致.

圖5 Pfu和Pfu－DbpADNA 聚合酶熒光實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)結(jié)果Fig.5 Fluorescence real－time data of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.7 耐鹽性結(jié)果與分析

鹽離子強(qiáng)度影響酶與模板的結(jié)合，DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力與耐鹽性存在正相關(guān)性.低持續(xù)合成能力的DNA 聚合酶使用低鹽濃度的緩沖液，高持續(xù)合成能力的DNA 聚合酶能使用高鹽濃度的緩沖液.增加DNA 聚合酶的耐鹽性使其能夠在更廣泛的緩沖液中使用.

配制EGFP擴(kuò)增反應(yīng)體系，逐步增加KCl濃度，PCR 擴(kuò)增EGFP.Pfu DNA 聚合酶的KCl耐受性較低，而Pfu－DbpA DNA 聚合酶的KCl耐受性得到了較大的提高，如圖6所示.因此，Pfu－DbpA DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力高于Pfu DNA 聚合酶，同時(shí)結(jié)果暗示Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度快于Pfu DNA聚合酶.

2.8 擴(kuò)增效率結(jié)果與分析

對DNA 聚合酶的改造，包括提高持續(xù)合成能力、延伸速度、保真性等，最終目的都是提高酶在實(shí)際應(yīng)用中的性能表現(xiàn).提高DNA 聚合酶的延伸速度使相同的延伸時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增更長的DNA 片段，或者擴(kuò)增相同的的DNA 片段花費(fèi)更少的時(shí)間.本研究通過擴(kuò)增0.5～15kbλDNA片段證明酶擴(kuò)增效率的提升.PCR擴(kuò)增程序延伸時(shí)間設(shè)為1min時(shí)，Pfu DNA 聚合酶能擴(kuò)增出少量2kb的產(chǎn)物，而Pfu－DbpA DNA聚合酶能擴(kuò)增出少量5kb的產(chǎn)物，如圖7所示.而兩種聚合酶均未能擴(kuò)增出8，10，12，15kb的λDNA 片段（結(jié)果未圖示）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Pfu－DbpA DNA聚合酶比Pfu DNA聚合酶具有更快的延伸速度，實(shí)際應(yīng)用效果也更好.

圖6 Pfu和Pfu－DbpADNA 聚合酶耐鹽性比較Fig.6 Comparison of salt tolerance of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

圖7 Pfu和Pfu－DbpA DNA 聚合酶擴(kuò)增效率比較Fig.7 Comparison of PCR efficiency of Pfu and Pfu－DbpA DNA polymerases

2.9 保真性檢測結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)以Pfu DNA 聚合酶、Pfu－DbpA DNA 聚合酶和Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增插入片段pLac－mRFP，經(jīng)酶切插入到載體，轉(zhuǎn)化至E.coli SURE2感受態(tài)細(xì)胞.因SURE2感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)無Lac啟動子的阻遏物L(fēng)acⅠ，Lac啟動子不需誘導(dǎo)即可啟動mRFP基因的表達(dá)，PCR 產(chǎn)物未突變則連接轉(zhuǎn)入E.coli SURE2感受態(tài)的質(zhì)粒表達(dá)出mRFP，菌落呈紅色；PCR 產(chǎn)物突變則連接轉(zhuǎn)入E.coli SURE2感受態(tài)的質(zhì)粒不表達(dá)mRFP或者突變的mRFP，菌落呈白色.白色菌落占總菌落比例反映pLac－mRFP的突變情況，即反映酶的保真性.Taq DNA 聚合酶用作對照，各種菌落形態(tài)的結(jié)果見圖8.

圖8 DNA 聚合酶保真性比較（彩頁見封3）Fig.8 Comparison of fidelity of DNA polymerases

圖8 DNA 聚合酶保真性比較Fig.8 Comparison of fidelity of DNA polymerases

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表3，Taq DNA 聚合酶具有較高的突變率，白色菌落占總菌落比例為12.5%，Pfu DNA 聚合酶具有高保真性，白色菌落占總菌落比例為1.66%.Taq DNA 聚合酶產(chǎn)物的突變比例是Pfu DNA 聚合酶產(chǎn)物突變比例的7.5倍，符合Taq DNA聚合酶突變率是Pfu DNA 聚合酶的7～8 倍.Pfu－DbpA DNA 聚合酶產(chǎn)物白色菌落占總菌落比例為1.53%.與Pfu DNA 聚合酶進(jìn)行t檢測P＝0.47＞0.05，說明Pfu－DbpA DNA 聚合酶與Pfu DNA 聚合酶保真性無明顯差異，DbpA 融合表達(dá)不影響Pfu DNA 聚合酶的高保真性.Pfu－DbpA DNA 聚合酶擴(kuò)增5kbλDNA 片段經(jīng)測序驗(yàn)證序列不存在突變，也證明Pfu－DbpA DNA 聚合酶具有高保真性.

表3 DNA聚合酶保真性比較Tab.3 Comparison of fidelity of DNA polymerase

3 討論

Pfu DNA 聚合酶是來自古生菌Pyrococcus furiosus，具有高保真性，但延伸速度慢，持續(xù)合成能力差.改造提高Pfu DNA 聚合酶的延伸速度和持續(xù)合成能力具有重要的使用價(jià)值.

在細(xì)胞內(nèi)存在“DNA sliding clamp”、thioredoxin、UL42等蛋白因子阻止DNA 聚合酶與模板的解離，提高DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力和延伸速度［18－20］.2004年，Wang等報(bào)道非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白Sso7d融合表達(dá)提高了DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力和延伸速度.Sso7d與雙鏈DNA 的結(jié)合阻止DNA聚合酶與模板的解離，提高了DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力，同時(shí)不影響酶的催化能力和dNTP的摻入效率.因具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定的特征，Sso7d不影響DNA 聚合酶自身的熱穩(wěn)定性.

其余非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白融合表達(dá)是否提高DNA 聚合酶的延伸速度和持續(xù)合成能力，以及是否存在效果優(yōu)于Sso7d的非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白尚屬未知.通過NCBI檢索發(fā)現(xiàn)，DbpA 是一種分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定的非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白.本研究探索DbpA 融合表達(dá)提高Pfu DNA 聚合酶的效果，擴(kuò)展已有對非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白提高DNA 聚合酶性能的認(rèn)知.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DbpA 融合表達(dá)得到Pfu－DbpA DNA 聚合酶不影響Pfu DNA 聚合酶自身的熱穩(wěn)定性和保真性.延伸速度實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)增效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度快于Pfu DNA 聚合酶.Pfu－DbpA DNA 聚合酶具有更高的耐鹽性，能夠適應(yīng)更廣泛的緩沖液體系，同時(shí)說明具有更強(qiáng)的持續(xù)合成能力.持續(xù)合成能力的提高導(dǎo)致延伸速度的加快，也暗示Pfu－DbpA DNA 聚合酶延伸速度比Pfu DNA 聚合酶快.但熒光實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明Pfu－DbpA DNA 聚合酶對Eva Green敏感，不適用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR.延伸速度加快導(dǎo)致Pfu－DbpA DNA 聚合酶在實(shí)際應(yīng)用中比Pfu DNA 聚合酶具有更好的效果.

通過與2004年Wang等的報(bào)道對比發(fā)現(xiàn)，DbpA 和Sso7d都能提高Pfu DNA 聚合酶的延伸速度和持續(xù)合成能力，但DbpA 效果比Sso7d差.說明非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白融合表達(dá)能增強(qiáng)DNA 聚合酶與模板的結(jié)合能力，從而提高DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力，進(jìn)而提高延伸速度并且不影響保真性.但非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白提高DNA 聚合酶性能存在分子特異性，因不同的雙鏈DNA 結(jié)合蛋白與DNA 結(jié)合能力不同，阻止DNA 聚合酶與DNA 模板解離的能力也不同.其余非特異性雙鏈DNA 結(jié)合蛋白對DNA 聚合酶性能提高的影響如何，效果是否優(yōu)于Sso7d仍有待進(jìn)一步的研究.

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