烤煙組培苗與常規(guī)苗大田防御酶活性的比較

許冬梅 ，王維，陳建軍，羅福命 ，張金霖 ，凌壽軍 ，陳俊 ，黃日偉，鄧世媛

1 華南農(nóng)業(yè)大學煙草研究室，廣東廣州，510642；2 廣東煙草清遠市有限公司，清遠，511515；3 廣東煙草連州市有限公司，連州，513400

烤煙組培苗與常規(guī)苗大田防御酶活性的比較

許冬梅1，王維1，陳建軍1，羅福命2，張金霖3，凌壽軍2，陳俊3，黃日偉3，鄧世媛1

1 華南農(nóng)業(yè)大學煙草研究室，廣東廣州，510642；2 廣東煙草清遠市有限公司，清遠，511515；3 廣東煙草連州市有限公司，連州，513400

為比較烤煙組培苗與常規(guī)苗煙苗素質(zhì)及大田期的抗性差異，以烤煙品種（系）K326、粵煙97、華煙06的組培苗與常規(guī)苗為試驗材料，測定了苗期農(nóng)藝性狀及根系活力和大田期多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、β-1，3-葡聚糖酶等防御性酶活性，并調(diào)查了田間發(fā)病率。結(jié)果表明：組培苗在株高、葉數(shù)、莖圍、根系體積、根系活力、干鮮重等方面均優(yōu)于常規(guī)苗。在整個大田生育期內(nèi)，不同處理烤煙的防御酶活性基本呈現(xiàn)出上升—下降—上升的變化趨勢。旺長期前，組培苗與常規(guī)苗之間防御酶活性差異不大，旺長期受到病蟲害侵染后，各處理的防御酶活性均先下降然后上升，并在較長一段時間內(nèi)處于較高水平，且組培苗防御酶活性增加的幅度高于常規(guī)苗，其中K326組培苗的PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶活性分別比常規(guī)苗高出29.58%、15.30%、73.03%，華煙06組培苗APX活性高于常規(guī)苗58.43%，差異顯著。組培苗的花葉病、氣候斑病及蟲害發(fā)生率等均低于常規(guī)苗，表現(xiàn)出較強的抗性。

烤煙；防御酶；組培苗；常規(guī)苗

傳統(tǒng)煙草育苗方式面臨著品種單一、品種自然退化、煙苗不均一、易感染病菌等問題[1-2]，通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖煙苗，可以保持煙草品種的優(yōu)良性、減少病蟲害的發(fā)生，提高煙葉的工業(yè)可用性，同時還可以保存優(yōu)良的種質(zhì)資源。隨著第一家蘭花組培苗工廠的建立，目前世界上80%～85%的蘭花是通過組織培養(yǎng)脫毒和快繁的，至今全國已建成葡萄、蘋果、香蕉、馬鈴薯、甘蔗、蘭花等快繁生產(chǎn)線10余條，年供應試管苗上億株，其中生產(chǎn)的香蕉試管苗已進入國際市場[3]。雖然在植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的早期，煙草作為模式植物為組培技術(shù)的發(fā)展作出了貢獻，但目前組培苗在煙草育苗中卻未得到很好的應用，對煙草組培苗生長發(fā)育過程中的生理特性也缺乏研究。

烤煙在大田生長期間會發(fā)生多種病蟲害。當病蟲害入侵植物體后，植物體內(nèi)會發(fā)生復雜的生理生化變化，其中之一便是啟動自身防御酶系統(tǒng)。多酚氧化酶（Polyphemol oxidase，PPO）與植物抵抗病原菌入侵有密切關系，同時也是防御害蟲取食的重要成員[4]；苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）活性在遭遇寒冷[5]、紫外輻射[6]、昆蟲取食[7]后會迅速上升；抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）是植物細胞中防御外界氧化脅迫和植物本身活性氧代謝的重要抗氧化酶類[8]；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-Glucanase）參與了植物對病原菌的防衛(wèi)反應，抑制真菌的生長增殖，它在植物體內(nèi)的誘導與積累，對于增強植物的抗病能力有重要作用[9]。組培苗是在無菌的條件下培育出來的，在抗病性方面具有一定的優(yōu)勢，目前關于組培苗抗病性的報道中，草莓[10]、桉樹[11]組培苗抗病性優(yōu)于常規(guī)苗，但對煙草組培苗抗病性的研究還未見報道。本試驗就是通過比較不同烤煙品種（系）組培苗與常規(guī)苗防御酶活性及大田抗病性的差異，研究組培苗田間抗性的表現(xiàn)及其機理，以期為組培苗應用于烤煙大田生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2013年12月至2014年7月在廣東省連州市唐屋村進行。試驗地前茬為水稻，土質(zhì)屬紫色砂頁巖發(fā)育而成的紫色土，土壤pH值為7.5，土壤主要養(yǎng)分含量為有機質(zhì)1.51%，全氮0.095%，全鉀（K2O）2.89%，堿解氮84 mg·kg-1，速效磷（P2O5）6.8 mg·kg-1，速效鉀（K2O）110 mg·kg-1。

供試烤煙品種為K326、粵煙97、華煙06（新品系），以各品種（系）組培苗和常規(guī)苗（CK）作為試驗材料，共6個處理，每處理3次重復、共18個小區(qū)，株行距為50 cm×120 cm。組培苗由華南農(nóng)業(yè)大學煙草研究室采用組織培養(yǎng)技術(shù)，取無菌苗葉片于適宜培養(yǎng)基上，通過愈傷組織的誘導、芽的分化繼代、生根壯苗獲得，并在移栽前進行了假植，常規(guī)苗在連州星子煙站通過漂浮育苗得到。試驗于3月13日移栽，4月8日揭膜，5月11日現(xiàn)蕾打頂，6月7日第一次采摘下部葉。施氮水平為153.7 kg·hm-2，N：P2O5：K2O=1：1.2：2.5，其他大田管理按照連州當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)范進行管理。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 防御性酶活性

取樣時間與方法：移栽前、揭膜后每隔12 d取一次，一直取到上部葉采收，每次均摘取倒四葉位葉片，去葉脈，放預冷研缽中研磨提取粗酶液。

PPO活性測定采用鄰苯二酚法，參照朱廣廉[12]的方法略有改動，反應體系包括0.2 mol.L-1鄰苯二酚1.5 mL，0.05 mol.L-1pH 6.8的磷酸緩沖液1.5 mL。1 g 葉片加少量聚乙烯吡咯烷酮、8 mL pH 6.8磷酸緩沖液冰浴研磨，4 ℃下13000 rpm離心20 min，取上清液50 μL，于398 nm處測2 min內(nèi)吸光度值的變化，不加酶液的反應為對照，以每分鐘A398變化1為1個酶活性單位U。

PAL活性測定參照李靖[13]的方法，反應體系中包括3.8 mL pH 8.8的硼酸緩沖液，1 mL 0.5 mol.L-1L-苯丙氨酸，0.2 mL酶液，40 ℃水浴1小時，于298 nm下測OD值，以每小時△OD變化0.01為1個酶活性單位U。

APX活性測定參照沈文飚[14]的方法，取煙葉0.5 g，加5 mL酶提取液冰浴研磨，4 ℃下10000 rpm離心20 min。在3 mL反應液中加入0.3 mL酶液，加0.05 mL H2O2啟動反應。不加H2O2為對照，測定290 nm波長下1 min OD值變化量，忽略H2O2對AsA極小的氧化作用，酶活性單位以每克鮮質(zhì)量每分鐘OD值變化來表示。

β-1,3-葡聚糖酶活性測定參照王旭麗等[15]的方法，取1 g煙葉加入4 mL 0.05 mol.L-1pH 5.0乙酸鈉緩沖液，冰浴研磨，4 ℃下14000 rpm離心15 min，反應體系包括0.4 mL 1 mg.mL-1昆布多糖，0.1 mL酶液，2.5 mL DNS液，顯色冷卻后測定540 nm波長處OD值，以每分鐘分解0.1 %昆布多糖產(chǎn)生1 μmol葡萄糖為1個酶活性單位U。

1.2.2 田間發(fā)病率

田間發(fā)病率調(diào)查方法參照GB/T23222—2008進行，從揭膜起每隔12d調(diào)查1次。每小區(qū)調(diào)查65株，共3次重復，主要記錄連州煙區(qū)煙草生產(chǎn)上容易發(fā)生的花葉病、氣候斑病及蟲害發(fā)生率。

1.3 烤煙生育期氣象資料

烤煙大田生育期氣象數(shù)據(jù)由http://www.wunderground.com/history/網(wǎng)站下載，見表1。

表1 連州市烤煙大田生育期氣象資料（2014年3月-7月）Tab.1 Meteorological data of fl ue-cured tobacco fi eld in the growth phase in Lianzhou(from March to July,2014)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用excel2010、SPSS18.0等軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙組培苗與常規(guī)苗苗期素質(zhì)的比較

表2顯示了成苗期不同品種（系）烤煙組培苗與常規(guī)苗的煙苗素質(zhì)。三個品種（系）組培苗的根系體積、根系活力、鮮重和干重、莖圍均顯著高于常規(guī)苗。組培苗K326、粵煙97和華煙06根系活力分別比常規(guī)苗高10.71%、10.55%、3.33%，干重高出12.50%、17.95%、18.52%，莖圍高出52.75%、45.36%、13.12%。

表2 烤煙組培苗與常規(guī)苗煙苗素質(zhì)的比較Tab.2 Comparison of tobacco seedling quality with different seedling methods

2.2 烤煙組培苗與常規(guī)苗PPO活性的比較

從圖1可以看出，移栽至還苗期間，各處理的PPO活性變化平緩，且組培苗與常規(guī)苗之間相差不大。進入旺長期后，組培苗與常規(guī)苗PPO含量均呈直線上升，在現(xiàn)蕾打頂期出現(xiàn)第一個峰值，此時華煙06、粵煙97、K326組培苗的PPO活性比常規(guī)苗分別高出16.40%、19.28%、29.58%，之后各處理PPO活性均出現(xiàn)小幅下降，到成熟期又上升達到另一個峰值，之后緩慢下降。整個生育進程中，三個品種（系）PPO活性變化趨勢基本一致，還苗期粵煙97組培苗的PPO活性略高于華煙06和K326的組培苗，但在團棵期、旺長期和成熟期后兩者PPO活性均不同程度的高于粵煙97組培苗。

2.3 烤煙組培苗與常規(guī)苗PAL活性的比較

圖2顯示了不同品種（系）烤煙組培苗與常規(guī)苗大田期間PAL活性的變化。從圖中可以看出，移栽至成熟，各處理的PAL活性總體呈現(xiàn)升—降—升的變化趨勢。旺長期之前，三個品種（系）的常規(guī)苗PAL活性均略高于組培苗，進入旺長期后，各品種（系）組培苗的PAL活性增加幅度都大于常規(guī)苗，圓頂期PAL活性出現(xiàn)小幅下降，之后一直升高并保持到采收時期，華煙06、粵煙97、K326組培苗的PAL活性分別比常規(guī)苗高出19.46%、20.63%、13.85%。從品種間來看，粵煙97組培苗PAL活性在苗期略低于華煙06和K326組培苗，成熟期粵煙97組培苗的PAL活性比K326組培苗低12.19%，有顯著性差異。

圖1 PPO活性變化Fig.1 Change of PPO activity

圖2 PAL活性變化 Fig.2 Change of PAL activity

2.4 烤煙組培苗與常規(guī)苗APX活性的比較

圖3顯示，各處理的APX活性均在移栽后即迅速上升，尤以粵煙97的上升速度最快。團棵之前，各品種（系）組培苗的APX活性均略低于常規(guī)苗，進入團棵之后，組培苗的APX活性增加幅度高于常規(guī)苗，尤其以華煙06組培苗的APX活性升高幅度最大，與常規(guī)苗相差最大達46.89%，粵煙97組培苗的APX活性也有較大幅度的增加，K326組培苗在此期間則變化較小。旺長期后，各品種（系）組培苗與常規(guī)苗的APX活性都出現(xiàn)了一個快速下降的過程，但隨后又迅速升高，粵煙97和K326在達到第二個峰值后緩慢下降，而華煙06則一直處于上升趨勢。現(xiàn)蕾打頂時，華煙06和粵煙97組培苗的APX活性分別比常規(guī)苗高出58.42%、37.55%，差異顯著，K326組培苗與常規(guī)苗APX活性的最大差異出現(xiàn)在采收初期，相差51.13%。從品種間來看，各品種（系）常規(guī)苗的APX活性相差不大，但華煙06組培苗的APX活性在團棵后明顯高于粵煙97和K326組培苗，在旺長期分別比粵煙97和K326組培苗高出34.29%、41.95%，采收時仍然高出43.93%、20.63%。

2.5 烤煙組培苗與常規(guī)苗β-1,3-葡聚糖酶活性的比較

由圖4得知，三個品種（系）組培苗與常規(guī)苗β-1,3-葡聚糖酶活性在移栽期至團棵期無明顯差異，進入旺長期后β-1,3-葡聚糖酶活性迅速上升，其中K326組培苗與常規(guī)苗相差73.04%，差異顯著，華煙06組培苗也比常規(guī)苗高出46.29%，而粵煙97組培苗與常規(guī)苗的酶活曲線幾乎重合，差異不明顯。隨后，各品種（系）組培苗與常規(guī)苗的β-1,3-葡聚糖酶活性又上升，華煙06和K326的組培苗在圓頂期比常規(guī)苗分別高44.29%、73.03%，差異顯著。較高水平的酶活性一直保持到落黃成熟期，但后期組培苗與常規(guī)苗之間的差異逐漸縮小。從不同品種（系）組培苗的β-1,3-葡聚糖酶活性比較來看，團棵之前以K326較高，旺長期華煙06組培苗低于粵煙97和K326組培苗。

圖3 APX活性變化Fig.3 Change of APX activity

圖4 β-1,3-葡聚糖酶活性變化Fig.4 Change of β-1,3-glucanase activity

2.6 烤煙組培苗與常規(guī)苗發(fā)病率的比較

從表3可以看出，在整個大田生育期內(nèi)，三個烤煙品種（系）組培苗的花葉病、氣候斑病及蟲害的發(fā)生率均低于常規(guī)苗?？緹煔夂虬卟《喟l(fā)于旺長期前，旺長期后發(fā)病率不再增加，品種K326表現(xiàn)出較好的抗性，無論是常規(guī)苗還是組培苗，發(fā)病率均為0；粵煙97的發(fā)病率比華煙06高，尤其是常規(guī)苗比華煙06高了66.81%；從組培苗與常規(guī)苗的比較來看，華煙06和粵煙97的組培苗分別比常規(guī)苗低33.41%、57.48%，差異顯著。煙草花葉病最早從品種K326開始發(fā)生，旺長期時三個品種（系）均有花葉病出現(xiàn)，且發(fā)病率上升速度較快，進入現(xiàn)蕾打頂期有所放緩，成熟期時K326、華煙06、粵煙97組培苗的花葉病發(fā)病率分別比常規(guī)苗低12.31、4.62、6.13個百分點；從品種（系）間來看，組培苗的發(fā)病率表現(xiàn)為粵煙97＞華煙06＞K326，而常規(guī)苗則表現(xiàn)為K326＞粵煙97＞華煙06。蟲害發(fā)生率高發(fā)于旺長期，這可能是由于連州煙區(qū)旺長期多為雨后晴朗高溫天氣、恰逢煙株葉片數(shù)量急劇增加，為蟲害的發(fā)生創(chuàng)造了有利條件，調(diào)查結(jié)果顯示，K326、華煙06、粵煙97組培苗的蟲害發(fā)生率分別比常規(guī)苗低52.73%、51.44%、49.46%，品種（系）間的表現(xiàn)則是K326最小、華煙06其次、粵煙97最高，常規(guī)苗也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

表3 烤煙大田生育期病蟲害發(fā)生率Tab.3 Incidence of disease and pests in fl ue-cured tobacco during the fi eld period

3 討論

烤煙組培苗在移栽前需要進行一段時間假植，即將無菌環(huán)境下培育出的組培苗移栽到育苗盤中進行煉苗。草莓[16]研究中發(fā)現(xiàn)，假植因移栽引起斷根，促發(fā)細根和初生根的發(fā)生，增加根重、擴大根系，使草莓苗旺苗壯，品質(zhì)得到大幅度提高。本試驗中，成苗期烤煙組培苗的株高、葉片數(shù)、根系體積、根系活力及干物質(zhì)的累積等各煙苗素質(zhì)指標均優(yōu)于常規(guī)苗。

前人研究表明，還苗期烤煙PPO活性較低，隨著生育進程逐漸增強，在旺長期開始上升，成熟期達到峰值之后逐漸下降[17]，還有人發(fā)現(xiàn)PPO活性在非正常落黃的煙葉中往往較高[18]。本試驗中，PPO活性在旺長期到達第一個峰值后出現(xiàn)短暫下降之后又迅速上升，成熟期有所回落，且組培苗高于常規(guī)苗。結(jié)合田間蟲害率發(fā)現(xiàn)，旺長期蟲害增長率最迅速，由此推測，為了抵抗外界侵害，煙株體內(nèi)防御酶系統(tǒng)產(chǎn)生生物應激反應，因此PPO活性又被激發(fā)上升，這與Constabel等[19]報道的機械損傷能強烈誘導煙草、楊樹中PPO活性上升的結(jié)果一致，各品種（系）組培苗的PPO活性高于常規(guī)苗，因而抗病性更強。

受煙草花葉病毒（TMV）侵染的煙草品種[20-21]和苜蓿花葉病毒侵染的菜豆葉片中[22]，PAL活性均顯著增強，且PAL活性變化趨勢一般均為具有2個酶峰的曲線[23]。本試驗中，煙葉感染TMV后，PAL活性增強，且在后期一直維持較高水平，組培苗的PAL活性高于常規(guī)苗，因此花葉病發(fā)生率顯著降低，說明PAL活性增強對烤煙抗病性有一定的促進作用。也有研究發(fā)現(xiàn)PAL活性提高率與蚜蟲取食誘導有關[24]，本試驗中，旺長期后三個烤煙品種（系）組培苗的PAL活性均高于常規(guī)苗，而蟲害發(fā)生率的結(jié)果顯示組培苗均遠低于常規(guī)苗，這可能是由于PAL參與植保素、木質(zhì)素、酚類物質(zhì)的合成，產(chǎn)生的機械障礙、毒害和趨避作用[20]，抵抗了害蟲的取食，因此降低了組培苗的蟲害發(fā)生率。

Charles等[25]研究大豆cAPXs觀察到，APX的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后調(diào)控可能增強農(nóng)作物抵抗環(huán)境脅迫的能力。本試驗結(jié)果表明，在容易發(fā)生病蟲害的旺長期，各處理的APX活性均有迅速增加的過程，且組培苗的增加幅度大于常規(guī)苗，因此病害發(fā)生率明顯比常規(guī)苗低。高溫脅迫下蘋果[26]、鴨梨[27]的APX活性會增加，本試驗也發(fā)現(xiàn)，成熟期煙株內(nèi)APX活性均上升，這可能與成熟期田間溫度較高有關，且組培苗在后期的APX活性也一直高于常規(guī)苗，因此更有利于抵抗病蟲害。

接種了寄生疫霉的煙草體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶活性較對照顯著升高，并認為真菌激發(fā)子的誘導具有激活植物系統(tǒng)抗病性的作用[28]。感染了病原菌后，大豆[29]、甜菜[30]、向日葵[31]、小麥[32-33]體內(nèi)的β-1,3-葡聚糖酶活性快速升高，且在較長時間內(nèi)維持著高活性。本試驗中，烤煙在旺長期受到病原菌和害蟲侵染后，β-1,3-葡聚糖酶活性也迅速上升，尤其是組培苗的升高幅度要大于常規(guī)苗，與發(fā)病率調(diào)查結(jié)果結(jié)合分析，可以認為β-1,3-葡聚糖酶活性與烤煙的抗病性密切相關。

4 結(jié)論

烤煙組培苗經(jīng)過假植、煉苗后，煙苗素質(zhì)優(yōu)于常規(guī)苗。大田生長過程中，在高溫、高濕、病蟲害高發(fā)的情況下，組培苗煙株體內(nèi)的PPO、PAL、APX、β-1,3-葡聚糖酶等酶活性高于常規(guī)苗，抗病蟲性表現(xiàn)更優(yōu)，因此，應用于大田生產(chǎn)具有一定的優(yōu)勢，可以作為未來煙草集約化、工廠化育苗方式發(fā)展的新方向，尤其是在煙草優(yōu)良種質(zhì)資源保存方面可發(fā)揮重要作用。

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Comparative study on activity of defensive enzymes between tissue culture seedlings and conventional seedlings of fl ue-cured tobacco

XU Dongmei1, WANG Wei1, CHEN Jianjun1, LUO Fuming2, ZHANG Jinlin3, LING Shoujun2, CHEN Jun3, HUANG Riwei3,DENG Shiyuan1
1 Tobacco Laboratory, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2 Guangdong Qingyuan Municipal Tobacco Company, Qingyuan 511515, Guangdong, China;3 Guangdong Lianzhou County Tobacco Company, Lianzhou 513400, China

Resistance capability difference between tissue culture seedlings and conventional seedlings was studied by using varieties(strains) K326, Yueyan97, and Huayan06, whose root activity and agronomic characters in seedling period, incidence rate and activities of PPO, PAL, APX , β-1,3-Glucanase during fi eld period were investigated. Results indicated that tissue culture seedlings outperformed conventional seedlings in terms of plant height, leaf number, stem girth, root volume, root activity and dry weight. Defensive enzyme activity was in the pattern of up-down-up, which meant that it increased at the start, then decreased and rose again in the fi nal period.Tissue culture seedlings showed no signi fi cant difference with conventional seedlings before vigorous growth stage. The enzyme activities decreased before increasing when infected by diseases and maintained at a high level for a long period. The increase of enzyme activities of tissue culture seedlings was higher than that of conventional seedlings. In particular, PPO, PAL and β-1,3-Glucanase of tissue culture seedling K326 was 29.58%, 15.30%, 73.03% higher than that of conventional seedlings respectively and Huayan06 tissue culture seedling’s APXA was 58.43% higher than that of conventional seedlings. The tissue culture seedling proved to have advantage in disease-resistance and insect-resistance.

fl ue-cured tobacco；defensive enzymes；tissue culture seedling；conventional seedling

許冬梅，王維，陳建軍,等. 烤煙組培苗與常規(guī)苗大田防御酶活性的比較[J]. 中國煙草學報，2015,21（4）

中國煙草總公司廣東省公司科技項目（201104，粵煙科【2011】28號）

許冬梅（1990— ），碩士研究生，研究方向為煙草栽培與品質(zhì)生理，Email:348241995@qq.com

鄧世媛（1975—），博士，副教授，研究方向為煙草栽培與品質(zhì)生理，Email: yydsy@scau.edu.cn

2014-08-15

:XU Dongmei, WANG Wei, CHEN Jianjun, et al. Comparative study on activity of defensive enzymes between tissue culture seedlings and conventional seedlings of fl ue-cured tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)